本發明專利技術提供了一種重組豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發明專利技術還提供了該蛋白的用途及一種ELISA檢測試劑盒。本發明專利技術的重組蛋白，抗原性、免疫原性好；以其作為包被抗原建立的ELISA檢測試劑盒，可以準確檢測豬流行性腹瀉病毒，同時本發明專利技術試劑盒的特異性強、靈敏度高、簡單、快速，制備方法簡單，成本低廉，為PEDV的診斷、普查和免疫檢測提供一種新選擇，臨床應用前景良好。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學
，具體涉及一種重組豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白及用其制備的ELISA檢測試劑盒。
技術介紹
豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。截止到2015年，PED已蔓延到大多數養豬國家，在歐洲、東南亞、美洲地區(美國、加拿大、墨西哥)、日本、韓國等地成為世界性的養豬疾病，給全球養豬業造成了巨大的經濟損失，PED已成為世界范圍內養豬業共同關注并急需解決的問題。目前，對PEDV的診斷方法主要有臨床診斷、ELISA、RT-PCR等。其中，ELISA方法即酶聯免疫吸附測定方法，即可檢測抗原，能夠直接檢測出糞便中的抗原，也可以檢測抗體，以評估豬場的PEDV疫苗免疫情況、感染豬的血清學診斷等，操作簡單、便于大批樣品的檢測，適用于基層及實驗室檢測。PDEV為單分子線狀正鏈單股RNA，其5’端加帽，3’端為聚A尾，具有感染性。基因組包含有5’-UTR、3’-UTR和至少7個ORF。這7個ORF中有4個編碼結構蛋白：纖突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、囊膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)，另3個編碼非結構蛋白：復制酶(replicase)1a、復制酶1b和ORF3蛋白。ORF3蛋白編碼一種離子通道蛋白，可調節病毒產生，與病毒的毒力有關。目前基于PEDV的M、N、S蛋白的ELISA診斷試劑盒均有報道，尚未有關于ORF3蛋白作為包被抗原的ELISA診斷盒。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種重組豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白及用其制備的ELISA檢測試劑盒。本專利技術提供了一種重組豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本專利技術還提供了編碼上述蛋白的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO：2所示。本專利技術還提供了一種重組質粒，它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；優選地，所述重組質粒為重組pET-22b質粒。本專利技術還提供了一種重組菌，它包含上述重組質粒；優選地，所述重組菌為重組大腸桿菌BL21(DE3)。本專利技術還提供了一種制備權利要求1所述重組蛋白的方法，其特征在于：它包含如下步驟：a、取上述重組菌，接種到添加有終濃度為100mg/L的氨芐青霉素的LB培養基中，37℃搖床培養，至OD600值達到0.5～0.7時，加入IPTG至終濃度為0.8～1.6mmol/L，25～37℃誘導表達3～7h；b、離心，收集菌體，分離純化，即可。本專利技術還提供了上述重組蛋白、上述核苷酸序列在制備檢測豬流行性腹瀉病毒的試劑中的用途。本專利技術還提供了一種ELISA檢測試劑盒，它是檢測待檢樣品中的抗豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA檢測試劑盒，以氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的重組豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白為抗原。其中，它還包括抗體包被液、洗滌液、封閉液、酶標二抗、顯色液以及終止液。其中，所述抗體包被液為碳酸鹽緩沖液；所述洗滌液為PBST緩沖液；所述封閉液為5％的脫脂牛奶；所述酶標二抗為辣根過氧化酶標記的兔抗豬二抗；所述顯色液為TMB顯色液；所述終止液為濃度為2mol/L的H2SO4溶液。本專利技術還提供了上述ELISA檢測試劑盒在制備檢測豬流行性腹瀉病毒的試劑中的用途。本專利技術提供的重組豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白，抗原性、免疫原性好；以ORF3蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA檢測試劑盒，可以準確檢測豬流行性腹瀉病毒，同時本專利技術試劑盒的特異性強、靈敏度高、簡單、快速，制備方法簡單，成本低廉，為PEDV的診斷、普查和免疫檢測提供一種新選擇，臨床應用前景良好。顯然，根據本專利技術的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本專利技術上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本專利技術的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本專利技術上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本專利技術上述內容所實現的技術均屬于本專利技術的范圍。附圖說明圖1為ORF3基因產物RT-PCR鑒定結果圖，M：DL2000；1：ORF3的RT-PCR產物；2：陰性對照。圖2為ORF3基因產物酶切鑒定結果圖，M:DL10000；1:空載pET-22b(+)；2:pET-22b(+)-ORF3的酶切產物。圖3為ORF3蛋白二級結構圖。圖4為ORF3蛋白不同誘導表達溫度圖，M：蛋白Marker；1：空載；2：37℃誘導；3：30℃誘導；4：25℃誘導。圖5為ORF3蛋白不同誘導表達IPTG濃度圖，M：蛋白Marker；1：空載；2：0.8mm/L；3:1.0mm/L；4：1.2mm/L；5：1.4mm/L；6：1.6mm/L；圖6為ORF3蛋白不同誘導表達時間圖，M：蛋白Marker；1：空載；2：3h；3：4h；4：5h；5：6h；6：7h。圖7為ORF3蛋白可溶性分析及純化圖，M：Marker；1：pET-22b(+)空載誘導后；2：重組蛋白誘導前；3：重組蛋白誘導后；4：破碎后上清；5：溶解后包涵體；6：純化后ORF3蛋白。圖8為Western-blot結果圖，M：Marker；1：目的蛋白；2：pET-22b(+)對照。具體實施方式下面以實施例作進一步說明，但本專利技術不局限于這些實施例。本專利技術所用的實驗試劑與儀器如下：1.1菌株及質粒大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)；pET-22b(+)原核表達載體均由本實驗室保存；PEDV、TGEV、PRoV、PRSSV、APP、HPS陽性血清、PEDV陰性血清、發病豬血清均是由本實驗室保存；1.2主要試劑MarkerⅢ、總RNA提取試劑盒、酵母提取物、胰蛋白胨、氨芐青霉素、50mg/ml IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、2xTaqPCR Mastermix、TMB顯色液、預染蛋白Marker III均購自天根生化有限公司；DL500、DL2000、DL5000、DL10000、Max DNA Polymerase、T4連接酶、PrimeScript RT reagent Kit、EcoR I和Xho I限制性內切酶均購自大連寶生物工程有限公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自OMEGA公司；SDS-PAGE試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液均購自北京索萊寶有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG、HRP標記的兔抗豬IgG均購自上海生工有限公司；蛋白質印跡膜和濾紙、Precision Plus ProteinTMWesternCTM、ClarityTM Western ECL Substrate均購自Bio-Rad公司。1.3主要儀器Legend Micro 17R centrifuge離心機、Sorvall ST 16R高速冷凍離心機、恒溫振蕩培養箱，美國Thermo公司；MyCyclerTM PCR儀、POWER Pac TM電泳儀及水平電泳槽、蛋白垂直電泳槽、UNIVERSAL HOOD凝膠成像系統、SmartspecTM Plus核酸蛋白儀、Model 680酶標儀，美國Bio-Rad公司；本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種重組豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技術特征摘要】
1.一種重組豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.編碼權利要求1所述蛋白的核苷酸序列，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：2所示。3.一種重組質粒，其特征在于：它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；優選地，所述重組質粒為重組pET-22b質粒。4.一種重組菌，其特征在于：它包含權利要求3所述的重組質粒；優選地，所述重組菌為重組大腸桿菌BL21(DE3)。5.一種制備權利要求1所述重組蛋白的方法，其特征在于：它包含如下步驟：a、取權利要求4所述的重組菌，接種到添加有終濃度為100mg/L的氨芐青霉素的LB培養基中，37℃搖床培養，至OD600值達到0.5～0.7時，加入IPTG至終濃度為0.8～1.6mmol/L，25～37℃誘導表達3～7h；b、離心，收集菌體，分離純化，即可。6.權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃小波，李亞青，文心田，曹三杰，文翼平，伍銳，張雨迪，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：四川;51
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