The invention belongs to the field of biological medicine, and relates to the preparation and application of a specific single chain antibody against avian origin, in particular to a method for preparing an avian genetic engineering antibody against canine parvovirus. The method of avian genetic engineering antibody to a process for the preparation of canine parvovirus, which comprises the following steps: (1) immunity of canine parvovirus like particles; (2) the establishment of phage antibody library of avian phage antibody; (3) by phage display technology of step (2) single chain antibody were obtained screening of specific anti canine parvovirus antibody; (4) based on the step (3) specific anti canine parvovirus antibody obtained by avian gene engineering antibody by prokaryotic expression.
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥領域，涉及一種特異性禽源單鏈抗體的制備和應用，具體涉及一種制備抗犬細小病毒的禽源基因工程抗體的方法。
技術(shù)介紹
犬細小病毒(Canine Parvovirus，CPV)屬細小病毒科，細小病毒屬。從發(fā)現(xiàn)該病毒至今，世界各地均有流行，是危害犬類的最主要的烈性傳染病之一。健康犬經(jīng)消化道感染病毒后，病毒主要攻擊兩種細胞，一種是腸上皮細胞，一種是心肌細胞，分別表現(xiàn)胃腸道癥狀和心肌炎癥狀，心肌炎以幼犬多見。犬接觸細小病毒后在3～14天內(nèi)出現(xiàn)體癥，平均發(fā)病時間為5～7天。臨床癥狀包括：食欲下降、沉郁、發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、糞便帶有犬細小病毒特有的腥臭味。犬細小病毒至今沒有特效藥物，但是可以通過止吐止拉等手段控制住病犬脫水情況，降低病犬負擔來治療。理論上診斷本病的方法很多，適合臨床醫(yī)生的有以下四種：1.流行病學診斷本病不分年齡，均可感染，主要是幼犬。直接接觸或間接接觸感染，主要通過消化道感染。2.癥狀學診斷特征癥狀是嘔吐、拉稀、拉血。具體根據(jù)早中期的癥狀來診斷。3.血常規(guī)檢查白細胞總數(shù)明顯減少，多數(shù)犬(92％)在9×109/L以下，少數(shù)犬(15％)在2×109/L以下。如果繼發(fā)細菌感染，白細胞總數(shù)可增高。4.試紙快速診斷法用北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心研制的犬細小病毒快速診斷試紙診斷本病，經(jīng)濟簡便、快速適用，有極高的準確率。由于禽源抗體多樣性主要是通過基因重組實現(xiàn)，擴增抗體可變區(qū)基因只需設計一對引物就可達到目的，不同于哺乳動物通過體細胞突變來增加抗體多樣性，需要設計多對引物實現(xiàn)可變區(qū)基因的擴增。這在抗體可變區(qū)基因的獲得上優(yōu)于哺乳動物抗體庫的構(gòu)建，保證...
【技術(shù)保護點】
一種制備抗犬細小病毒的禽源基因工程抗體的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)犬細小病毒樣粒子的免疫(11)選取生產(chǎn)狀態(tài)良好的60～70日齡未開產(chǎn)母雞5只；(12)將犬細小病毒樣粒子與免疫佐劑等體積混合、乳化后，通過胸肌四點肌注對步驟(11)中的母雞進行初次免疫，免疫劑量為200～1000μg/kg，免疫佐劑為完全弗氏佐劑；(13)初次免疫14天后，對步驟(2)中的母雞依次進行四次加強免疫，每次加強免疫的間隔時間為14天，加強免疫時，將犬細小病毒樣粒子與免疫佐劑等體積混合、乳化后，通過胸肌四點肌注對母雞進行加強免疫，免疫劑量為200～1000μg/kg，免疫佐劑為不完全弗氏佐劑；(2)禽源單鏈抗體的噬菌體抗體庫的建立(21)待步驟(13)中的母雞五次免疫完成后，收集其脾臟組織，?80℃儲存；(22)使用總RNA提取試劑盒提取步驟(21)得到的脾臟組織的總RNA；(23)對步驟(22)得到的脾臟組織總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到脾臟組織cDNA；(24)使用兩對特異性引物以脾臟組織cDNA為模板分別擴增輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，接著使用重疊聚合酶鏈式反應組裝成禽源單鏈抗體片段,其中，兩對特異性引...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種制備抗犬細小病毒的禽源基因工程抗體的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)犬細小病毒樣粒子的免疫(11)選取生產(chǎn)狀態(tài)良好的60～70日齡未開產(chǎn)母雞5只；(12)將犬細小病毒樣粒子與免疫佐劑等體積混合、乳化后，通過胸肌四點肌注對步驟(11)中的母雞進行初次免疫，免疫劑量為200～1000μg/kg，免疫佐劑為完全弗氏佐劑；(13)初次免疫14天后，對步驟(2)中的母雞依次進行四次加強免疫，每次加強免疫的間隔時間為14天，加強免疫時，將犬細小病毒樣粒子與免疫佐劑等體積混合、乳化后，通過胸肌四點肌注對母雞進行加強免疫，免疫劑量為200～1000μg/kg，免疫佐劑為不完全弗氏佐劑；(2)禽源單鏈抗體的噬菌體抗體庫的建立(21)待步驟(13)中的母雞五次免疫完成后，收集其脾臟組織，-80℃儲存；(22)使用總RNA提取試劑盒提取步驟(21)得到的脾臟組織的總RNA；(23)對步驟(22)得到的脾臟組織總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到脾臟組織cDNA；(24)使用兩對特異性引物以脾臟組織cDNA為模板分別擴增輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，接著使用重疊聚合酶鏈式反應組裝成禽源單鏈抗體片段,其中，兩對特異性引物包括引物HF-Sif I、引物HR-Linker、引物LF-Linker和引物LR-Not I，引物HF-Sif I:5’-ATGTCTATGGCCCAGCCGGCCGTGACGTTGGACG-3’；引物HR-Linker:5’-CAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGAGGAGACGATGAC-3’；引物LF-Linker:5’-TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCT-3’；引物LR-Not I:5’-AGTTACTGGAGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGGG-3’；(25)建立噬菌體抗體庫(251)將步驟(24)獲得的禽源單鏈抗體片段分別用引物Sif I和引物Not I酶切，再將pCANTAB5E噬菌粒載體分別用引物Sif I和引物Not I酶切；(252)將步驟(251)得到的酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，使用T4-DNA連接酶將酶切禽源單鏈抗體片段與酶切pCANTAB5E噬菌粒載體連接在一起；(253)將步驟(252)得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TG1大腸桿菌中，并將其涂布于SOB固體培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)12-16小時，其中該SOB固體培養(yǎng)基中加入了2uL氨芐霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；(254)將步驟(253)中SOB固體培養(yǎng)基上的菌落用5mL 2×YT培養(yǎng)基洗脫下來，加入等體積的50％滅菌甘油，放入-80℃存儲備用；(3)通過噬菌體展示技術(shù)對步驟(2)得到的單鏈抗體進行篩選，得到特異性抗犬細小病毒單鏈抗體；(4)基于步驟(3)得到的特異性抗犬細小病毒單鏈抗體通過原核表達獲得禽源基因工程單鏈抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備抗犬細小病毒的禽源基因工程抗體的方法，其特征在于，步驟(3)包括以下步驟：(301)將3mL步驟(2)得到的噬菌體抗體庫加入到250mL 2×YT培養(yǎng)基中，37℃,持續(xù)震蕩培養(yǎng)，該2×YT培養(yǎng)基含有5ml 20wt％的葡萄糖水溶液；(302)每隔一小時，用分光光度計測定步驟(301)中的培養(yǎng)基的細菌濃度，待步驟(301)中的培養(yǎng)基的菌液OD600為0.4～0.6時，向培養(yǎng)基中加入1×1012pfu的M13KO7輔助噬菌體及250μL的濃度為100mg/mL的氨芐霉素溶液，37℃，100rpm輕搖感染0.5h之后，再37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)0.5h；(303)將步驟(302)中的培養(yǎng)基離心15分鐘，去上清，得到細菌沉淀，其中，離心時的離心力為5000×g；(304)用500mL的2×YT培養(yǎng)基懸浮步驟(303)得到的細菌沉淀，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；(305)用2mL濃度為10μg/mL的犬細小病毒樣粒子包被免疫管得到第一免疫管，4℃孵育12～16小時備用；(306)將步驟(304)中的培養(yǎng)基以5 000×g離心20分鐘，將上清移至另一滅菌的錐形瓶中，再向該錐形瓶中加入100mL的聚乙二醇6000和氯化鈉混合水溶液，冰浴30分鐘以沉淀噬菌體，其中：該混合水溶液中含有20g聚乙二醇6000和14.61g的氯化鈉；(307)將步驟(306)錐形瓶中的溶液以10 000×g，4℃離心20分鐘，棄去上清，得到細菌沉淀；(308)用3mL 2×YT培養(yǎng)基重懸步驟(307)得到的細菌沉淀，然后以5 000×g離心15分鐘，取2mL上清待用；(309)將2mL 2wt％脫脂奶粉水溶液加入到步驟(308)得到的2mL上清中，室溫去干擾化處理20分鐘得到混合液；(310)將步驟(305)得到的第一免疫管取出，用4mL磷酸鹽緩沖液洗滌3次，甩干，然后加入4mL封閉液37℃封閉2h；(311)再將步驟(310)中的第一免疫管中的封閉液倒去，再用4mL磷酸鹽緩沖液洗滌3次，甩干后備用；(312)將步驟(309)得到的混合液加入步驟(311)的第一免疫管內(nèi)，37℃靜置溫育2h；(313)棄去步驟(312)中第一免疫管的混合液，用含有0.2v/v％吐溫20的磷酸鹽緩沖液震蕩洗滌10次第一免疫管，每次10分鐘，再用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，甩干備用；(314)向步驟(313)中的第一免疫管加入2mL PH為2.3的甘氨酸-鹽酸緩沖液，37℃，150rpm轉(zhuǎn)動洗脫5分鐘后，再加入2mL的PH為7.4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，最后將混合液轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管中,其中PH為2.3的甘氨酸-鹽酸緩沖液中的甘氨酸的摩爾濃度為0.2mol/L；(315)向步驟(314)中空的第一免疫管加入4mL對數(shù)期TG1菌液洗滌，然后將第一免疫管中的對數(shù)期TG1大腸桿菌菌液加入步驟(314)中的離心管中，37℃，150rpm振蕩培養(yǎng)1h，獲得一級抗體庫，然后取0.01ml的一級抗體庫10-8稀釋后放入SOB固體培養(yǎng)基計算庫容，該SOB固體培養(yǎng)基中加入了2uL氨芐霉素和400uL 20wt％的葡萄糖水溶液；(316)將2mL步驟(315)得到的一級抗體庫加入到250mL的2×YT培養(yǎng)基中，37℃,持續(xù)震蕩培養(yǎng)；(317)每隔一小時，用分光光度計測定步驟(316)培養(yǎng)基中的細菌濃度，待步驟(316)培養(yǎng)基中的菌液OD600為0.4～0.6時，然后向培養(yǎng)基中加入1×1012pfu的M13KO7輔助噬菌體及250μL的濃度為100mg/mL的氨芐霉素溶液，37℃，100rpm輕搖感染0.5h之后，再37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)0.5h；(318)將步驟(317)中的培養(yǎng)基5 000×g離心15分鐘，去上清，得到細菌沉淀；(319)用500mL的2×YT培養(yǎng)基懸浮步驟(318)得到的細菌沉淀，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)12～16小時；(320)用2mL濃度為5μg/mL的犬細小病毒樣粒子包被免疫管得到第二免疫管，4℃孵育12～16小時備用；(321)將步驟(319)中的培養(yǎng)基以5 000×g離心20分鐘，將上清移至另一經(jīng)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張小鶯，李翠，
申請(專利權(quán))人：西北農(nóng)林科技大學，
類型：發(fā)明
國別省市：陜西;61
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