一種抗微生物肽Cm?CATH2及其制備方法和應用，Cm?CATH2是一種直鏈多肽，含有33個氨基酸殘基，理論等電點為12.96，分子量是4089.97Da，凈電荷為+12。編碼抗微生物肽Cm?CATH2前體cathelicidin的基因由486個核苷酸組成。Cm?CATH2對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌均有很強的抗菌活性，包括多種臨床耐藥菌，并且最小抑菌濃度很低，殺菌效果快速且持久；其不含有二硫鍵及環狀結構，方便化學合成及基因工程制備；還具有低溶血、低細胞毒、不易產生耐藥性等特點，可替代抗生素制備抗病原微生物感染，消炎等臨床藥物，以及化妝品、保健品、食品、飼料等日化中的添加劑被應用，有很好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術提供一種來源于綠海龜(C.mydas)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Cm-CATH2及其制備方法和在抗病原微生物感染、消炎等臨床藥物、化妝品、保健品、食品、飼料的添加劑等中的應用，屬于生物醫學
技術介紹
Cathelicidin是一類多功能的抗菌肽，在哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、以及魚類中均發現其存在。自首次從牛中性粒白細胞中發現Bac5后，越來越多的Cathelicidin抗菌肽得以鑒定。Cathelicidin通常以前體的形式合成，包括N端的大約30個氨基酸殘基的信號肽，保守的cathelin結構域及C端高度特異的成熟肽區域，三個部分組成。Cathelicidin前體到達作用部位后，在水解酶的作用下迅速釋放cathelin結構域和成熟肽，發揮抗菌、免疫調節的作用。大量的抗菌肽活性研究顯示，Cathelicidin是一種高效廣譜的抗菌類藥物，甚至對臨床上分離的高耐藥性細菌也具有良好的抑制效果，對許多致病菌殺害作用的速度要遠遠大于傳統抗生素的作用，因此被視為理想的設計新型抗生素的模板。除此之外，Cathelicidin還具有抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤癌等多種功能，而且絕大多數抗菌肽對哺乳動物細胞無毒性作用；還具有對多種免疫細胞具有趨化作用、誘導肥大細胞脫粒和組織胺釋放、調節巨噬細胞轉錄、促進傷口愈合、誘導血管發生、誘導變異細胞系細胞凋亡和淋巴細胞活化等生物活性，因此Cathelicidin在醫藥、畜牧業、食品和化妝品等領域具有很好的應用前景。目前抗菌肽的應用主要集中于醫藥領域的開發，并且取得了一些令人滿意的成果，已經有許多新型藥物逐步邁入醫藥市場。比如，來自爪蟾抗菌肽Magainin的Pexiganan，由Genaera公司開發，目前以外用霜劑的形式用來治療膿皰病和糖尿病患者足底潰爛等，已經進入臨床III期試驗階段，它也是第一個進行商業開發的抗菌肽；Daptomycin是一種陰離子抗菌肽，由Cubit Pharmaceuticals公司研發，2003年9月由美國食品與藥物管理局(FDA)批準上市；來自豬白細胞的Iseganan，由Intrabiotics公司開發，用藥途徑是口服液或噴霧劑，用來治療抗腫瘤治療引發的口腔炎和囊腫性纖維化病人肺感染，目前也處于臨床III期試驗階段；來自于牛的MBI-肽，由Micrologix生物技術公司，以外用乳膏的形式用來治療尿道相關的血流感染，處于III期臨床；來自人唾液的Histatin衍生肽，做成口腔洗劑，用來治療牙根炎和口腔感染(II-III期臨床)、口腔念珠菌感染(II期臨床)和慢性綠膿桿菌感染(I期臨床)?？梢?，抗菌肽在醫藥領域有著很好的應用前景。抗菌肽的應用不局限于醫藥領域，動物飼料、化妝品、保健品、食品等中也有很好的應用?？股刈黠暳咸砑觿┑氖褂迷缫岩鹆藸幾h，世界衛生組織發表公告指出“在牲畜養殖 過程中，停止以往慣用的飼料添加劑抗生素的做法，將在不危害動物和農民利益的前提下，可減少對人類健康的威脅”?？股刈鳛轱暳咸砑觿糜趧游锷a中，對畜牧業的發展起了重要的作用，但是其在動物體內和動物產品中的殘留，以及病原菌產生的抗藥性問題，對人類的健康和環境產生了負面的影響。美國的R&D報道，抗茵肽可作為飼料防霉劑；溫劉發等應用含抗茵肽的柞蠶免疫血淋巴粉添加于斷奶仔豬飼料中，飼喂試驗表明，柞蠶抗茵肽可減輕斷奶仔豬的腹瀉。他們又將抗茵肽的發酵制劑制作為飼料添加劑喂粵黃雞，研究表明該制劑可促進小雞生長和減少排泄物氮含量?？咕木哂袕V譜的抗菌作用，對畜禽具有促生長和治療疾病的功能，是無毒、無害、無殘留的綠色產品，其成分為易消化吸收的氨基酸，可作為畜禽飼料添加劑取代或部分取代飼喂動物所用的抗生素，將會減少抗生素對動物體的危害，避免抗生素殘留對人類的傷害。另外，化妝品、保健品、食品中會添加一些添加劑，比如防腐劑，抗氧化劑等，為了抑制食品微生物生長和繁殖，延長食品的保存時間，但是這些添加劑往往被擅自濫用，給人身體帶來巨大傷害，特別是有致癌的副作用，所以可以用抗菌肽替代防腐劑和抗氧化劑。綠蠵龜(C.mydas)又名綠海龜，是各種海龜中體形較大的一種，和其他海龜一樣，除了上岸產卵外，終其一生都在大洋中渡過。它廣泛分布于熱帶及亞熱帶之海域，并產卵於溫度達25C以上的沙灘。覓食區多為海草豐富的淺水區，為草食性動物，是海龜里唯一攝食較多海藻的種類。目前關于綠海龜cathelicidin宿主防御肽的研究和應用還沒有報道。
技術實現思路
本專利技術提供一種來源于綠海龜(C.mydas)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Cm-CATH2及其編碼基因和制備方法，主要應用于制備抗病原微生物感染、消炎等臨床藥物及在化妝品、保健品、食品、飼料中作為添加劑。為了實現本專利技術的目的，本專利技術提供了如下技術方案：抗微生物肽Cm-CATH2的分離純化方法：選取綠海龜脾臟組織，洗滌，勻漿，獲得脾臟組織蛋白粗提物。隨后，Sephadex G-50凝膠過濾層析，用自動部分收集器收集3mL/管，220nm檢測并收集各峰檢測抗菌活性，凍干備用。然后經反相高壓液相層析(RP-HPLC)進行梯度洗脫，收集各多肽樣品峰，用滅菌去離子水溶解，檢測抗菌活性。最后對得到多肽樣品進行一級結構的解析，包括采用電噴霧四級桿飛行時間串聯質譜法(ESI-Q-TOF-MS,Biosystems/MDS Sciex多倫多，加拿大)測定分子量。利用等電聚焦電泳測定其等電點，用Edman降解法確定其多肽氨基酸序列組成。多肽全序列一級結構為：精氨酸-精氨酸-絲氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-苯丙 氨酸-賴氨酸-賴氨酸-纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-纈氨酸-亮氨酸-精氨酸-組氨酸-絲氨酸-精氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-苯丙氨酸。綠海龜Cm-CATH2基因的克隆包括:綠海龜肝臟總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，設計引物，利用PCR方法篩選綠海龜抗菌肽Cm-CATH2基因。獲得陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定?；驕y序結果表明編碼抗微生物肽Cm-CATH2前體cathelicidin的基因由486個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:其中385到483位是編碼抗微生物肽Cm-CATH2的核苷酸序列，其編碼氨基酸序列為:精氨酸1-精氨酸2-絲氨酸3-精氨酸4-苯丙氨酸5-甘氨酸6-精氨酸7-苯丙氨酸8-苯丙氨酸9-賴氨酸 10-賴氨酸11-纈氨酸12-精氨酸13-賴氨酸14-谷氨酰胺15-亮氨酸16-甘氨酸17-精氨酸18-纈氨酸19-亮氨酸20-精氨酸21-組氨酸22-絲氨酸23-精氨酸24-異亮氨酸25-蘇氨酸26-纈氨酸27-甘氨酸28-甘氨酸29-精氨酸30-甲硫氨酸31-精氨酸32-苯丙氨酸33?？刮⑸镫腃m-CATH2的合成，包括以下步驟：(1)根據基因編碼的Cm-CATH2氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列；(2)通過HPLC反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于97％；(3)用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜測定其分子量；等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種抗微生物肽Cm?CATH2，其特征在于，Cm?CATH2是一種直鏈多肽，含有33個氨基酸殘基，理論等電點為12.96，分子量是4089.97Da，凈電荷為+12，其全序列一級結構為：精氨酸?精氨酸?絲氨酸?精氨酸?苯丙氨酸?甘氨酸?精氨酸?苯丙氨酸?苯丙氨酸?賴氨酸?賴氨酸?纈氨酸?精氨酸?賴氨酸?谷氨酰胺?亮氨酸?甘氨酸?精氨酸?纈氨酸?亮氨酸?精氨酸?組氨酸?絲氨酸?精氨酸?異亮氨酸?蘇氨酸?纈氨酸?甘氨酸?甘氨酸?精氨酸?甲硫氨酸?精氨酸?苯丙氨酸(RRSRFGRFFKKVRKQLGRVLRHSRITVGGRMRF)；編碼抗微生物肽Cm?CATH2前體cathelicidin的基因由486個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:其中385到483位是編碼抗微生物肽Cm?CATH2的核苷酸序列。
【技術特征摘要】
1.一種抗微生物肽Cm-CATH2，其特征在于，Cm-CATH2是一種直鏈多肽，含有33個氨基酸殘基，理論等電點為12.96，分子量是4089.97Da，凈電荷為+12，其全序列一級結構為：精氨酸-精氨酸-絲氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-賴氨酸-纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-纈氨酸-亮氨酸-精氨酸-組氨酸-絲氨酸-精氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-苯丙氨酸(RRSRFGRFFKKVRKQLGRVLRHSRITVGGRMRF)；編碼抗微生物肽Cm-CATH2前體cathelicidin的基因由486個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:其中385到483位是編碼抗微生物肽Cm-CATH2的核苷酸序列。2.權利要求1所述一種抗微生物肽Cm-CATH2的制...
【專利技術屬性】
技術研發人員：于海寧，王義鵬，喬雪，高久香，
申請(專利權)人：大連理工大學，
類型：發明
國別省市：遼寧;21
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