用于對暴露于顆粒物2.5(PM2.5)進行鑒別的微RNA及使用該微RNA進行鑒別的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及微RNA在對暴露于顆粒物2.5(PM2.5)進行鑒別方面的用途，以及使用該微RNA對暴露于PM2.5進行鑒別的方法。更精確地，當將小鼠模型暴露于PM2.5水溶性提取物和PM2.5有機可溶性提取物時，確認了一種微RNA以正常水平1.3倍的水平過表達。因此，該選定的微RNA可用作監(jiān)測PM2.5和評估PM2.5風(fēng)險的生物標志物，并可用作檢驗PM2.5毒性機制的工具。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及用于對暴露(exposure)于顆粒物2.5(PM2.5)進行鑒別的微RNA(microRNA)及使用該微RNA進行鑒別的方法。
技術(shù)介紹
最近，微RNA(miR、miRNA)上升為參與基因表達調(diào)控的重要的調(diào)控RNA。此類小的非編碼RNA分子(通常由18-24個核苷酸組成)可通過參與RNA降解、mRNA翻譯和基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)控蛋白表達模式。所述微RNA調(diào)控多種生物過程，例如發(fā)育、分化、細胞增殖、應(yīng)激應(yīng)答等。已知高等真核生物包含約1000種微RNA。微RNA由RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III；Qi，P.等，Cell.Mol.Immunol.3，411-419，2006)轉(zhuǎn)錄，可由各miRNA基因的此類轉(zhuǎn)錄物、編碼蛋白的基因的內(nèi)含子或多順反子編碼的緊密相關(guān)的miRNA誘導(dǎo)。借助RNA pol II或pol III進行的miRNA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長度為數(shù)千個核苷酸的第一轉(zhuǎn)錄物，該第一轉(zhuǎn)錄物被稱為初級miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)。在細胞核中，由RNase和Drosha對pri-miRNA進行加工，生成由70-100個核苷酸構(gòu)成的發(fā)卡類型的pre-miRNA。一旦轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中，由dicer對發(fā)卡pre-miRNA進行再次加工，生成雙鏈miRNA。成熟miRNA鏈混入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中。隨后，成熟miRNA在RISC中通過堿基對互補與靶mRNA結(jié)合。當miRNA堿基對與mRNA靶標完美匹配時(非常罕見)，促進mRNA降解。一般而言，miRNA與靶mRNA形成不完全的異源雙鏈，這影響mRNA翻譯。miRNA機制對癌癥發(fā)展、細胞衰老和器官生長等具有重要影響。因此，對miRNA的研究不僅對于研究癌癥發(fā)展、衰老及其對人類壽命的影響而言是重要的，還應(yīng)用在對使用干細胞的細胞治療產(chǎn)品進行篩選、以及發(fā)育、分化的研究中，這表明miRNA可作為韓國生物研究的核心靶標。因此，微RNA標志物的篩選對于包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的預(yù)測或早期診斷而言將是非常有幫助的。大家還認為，微RNA標志物對于預(yù)測暴露于特定的環(huán)境有害物質(zhì)而言將是有用的。直到最近，研究主要關(guān)注于由暴露于環(huán)境有害物質(zhì)誘導(dǎo)的mRNA的改變，以及改變的mRNA與疾病的關(guān)聯(lián)。根據(jù)最近提出并引人關(guān)注的微RNA與疾病的牽連，研究了暴露于有害物質(zhì)(例如苯、砷或RDX)的情況下微RNA的表達模式。其結(jié)果是，表達模式呈靶標特異性改變的微RNA及其靶基因已被提議作為所述有害物質(zhì)的標志物(Baccarelli，A.和Bollati，V.Curr.Opin.Prediatr.，21，243-251，2009)。所鑒別的微RNA不僅是用于對暴露進行預(yù)測的標志物，還是能夠調(diào)控靶基因表達的基因表達調(diào)控子，表明微RNA也可有利地作為對由環(huán)境有害物質(zhì)導(dǎo)致的毒性進行預(yù)測的標志物。雖然微RNA在對暴露于環(huán)境有害物質(zhì)及由此所導(dǎo)致的毒性進行預(yù)測方面起到重要作用，對微RNA的研究還局限于利用微RNA開發(fā)疾病診斷的標志物。特別地，還未對當暴露于環(huán)境物質(zhì)(例如由自然和環(huán)境來源產(chǎn)生、且一直存在而使暴露持續(xù)的顆粒物)時作為改變主體的微RNA表達模式進行透徹研究。表觀遺傳改變并不像遺傳修飾(如基因表達模式改變)那樣廣泛。因此，與需要大量標志物的基因表達譜相比，表觀遺傳標志物(例如微RNA或DNA甲基化)可簡單地利用僅一個標志物來促進對暴露于有害物質(zhì)的早期鑒別，并且對于非侵入性方法而言是有利的。各微RNA調(diào)控多個靶基因。在高等真核生物中存在上千個微RNA。因此，預(yù)期存在大量可被微RNA調(diào)控的潛在循環(huán)通路(cycles)。尺寸為10μm(1μm＝0.001mm)以下的灰塵被稱為顆粒物。由燃料燃燒人為產(chǎn)生的顆粒物大致分為兩組：直徑10μm以下為PM10，直徑2.5μm以下為PM2.5，PM2.5被稱為細顆粒物。一般而言，可能對人類造成嚴重危害的PM2.5是由燃料燃燒產(chǎn)生的。鍋爐、汽車和電廠也為主要來源。從建筑工地和道路彌散的灰塵也構(gòu)成PM2.5的一大部分。由于PM2.5的尺寸更小，在空氣中移動速度更快。據(jù)推測，1/3的PM2.5來自于遠距離遷移，1/3由本地直接產(chǎn)生，1/3歸因于空氣中的反應(yīng)。由于PM2.5具有2.5μm以下的直徑，極難通過肉眼分辨。PM2.5能夠深入侵入肺泡。PM2.5主要通過呼吸被吸入人體內(nèi)。PM2.5由燃料燃燒產(chǎn)生，因此，特別是在制造業(yè)工廠、交通繁忙的道路和電廠等處，暴
露于PM2.5的風(fēng)險很高。PM2.5是以呼吸系統(tǒng)為途徑誘發(fā)肺病的物質(zhì)之一。由于顆粒非常小，PM2.5可不被鼻黏膜過濾而侵入肺泡，長時間暴露于PM2.5可能是多種疾病(包括哮喘、過敏(atopy)和肺癌等)的原因，從而可能增加早逝率。由于該風(fēng)險，根據(jù)室內(nèi)空氣質(zhì)量管理法，對于PM2.5而言，新公寓式住宅的室內(nèi)空氣質(zhì)量的環(huán)境空氣質(zhì)量標準嚴格限制在年平均值為25μg/m3以下且日平均值為50μg/m3以下。最近涌現(xiàn)的報道指出，PM2.5顯著威脅我們的健康，因而新環(huán)境標準(年平均值25μg/m3)從2015年生效。由于PM2.5具有細顆粒物的特征(例如高流動性；并且，取決于地區(qū)，分布、濃度和組成具有高度的多樣性和差異)，韓國關(guān)于PM2.5污染水平的記錄信息不足。韓國環(huán)境部迫切地進行調(diào)查，試圖通過收集PM2.5的遠距離遷移性以及區(qū)域組成的差別方面的信息(特別關(guān)注于產(chǎn)生大量PM2.5的設(shè)施)來提供有效的計劃。雖然一些研究報道了PM10對人的毒性、PM10的組成及PM10造成的基因表達模式改變，對PM2.5的研究目前僅局限于其組成。雖然對人而言PM2.5具有潛在風(fēng)險，對PM2.5的風(fēng)險評估數(shù)據(jù)仍然不足，對健康益處(假定WHO推薦的PM2.5濃度滿足空氣質(zhì)量標準，該健康益處由改良PM2.5濃度所實現(xiàn)的過早死亡的降低而產(chǎn)生)進行計算的分析方法仍然存在不確定性和局限性。因此，非常迫切地需要通過使用微陣列芯片或借助引物的實時PCR來對人類風(fēng)險進行快速評估，以開發(fā)出對人類毒性以及參與多種疾病發(fā)展(特別包括癌癥)的微RNA的表達模式進行篩選的分子標志物；并非常迫切地需要基于在小鼠模型中對PM2.5暴露進行評估的方法，利用所述標志物制定和管理針對暴露于PM2.5的合適對策。自1997年微RNA首次被鑒別以來，已快速鑒別了哺乳動物和微生物中的大量微RNA，并已報告至Sanger miRBASE數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/index.shtml)。基于已建立的微RNA數(shù)據(jù)，采用一次即可對數(shù)千基因的表達同時進行分析的微陣列實施的基因組范圍的
表達研究(Schena，M等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，10614-10619，1996)正在進行，以揭示基因功能。通過將cDNA(互補DNA)或20-25個堿基對長度的寡核苷酸組整合在玻璃上來制備微陣列。學(xué)校或公司(包括Agilent或Genomic Solutions)的實驗室已通過將cDNA集合機械固定在芯片上或利用噴墨(ink jetting)制備了cDNA微陣列(Sellheyer K.等，J.Am.Acad.Dermatol.，51，681-692，20本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
微陣列芯片在對暴露于PM2.5進行鑒別方面的用途，所述微陣列芯片上整合有如下微RNA的cDNA：miRNA?Mm?miR?1943?3p，所述Mm?miR?1943?3p在miRbase中的微RNA登記號為MIMAT0017342，所述Mm?miR?1943?3p的序列由SEQ.ID.NO：1示出。

【技術(shù)特征摘要】
2014.11.12 KR 10-2014-01569301.微陣列芯片在對暴露于PM2.5進行鑒別方面的用途，所述微陣列芯片上整合有如下微RNA的cDNA：miRNA Mm-miR-1943-3p，所述Mm-miR-1943-3p在miRbase中的微RNA登記號為MIMAT0017342，所述Mm-miR-1943-3p的序列由SEQ.ID.NO：1示出。2.如權(quán)利要求1所述的微陣列芯片在對暴露于PM2.5進行鑒別方面的用途，其特征在于，所述PM2.5為PM2.5的水溶性提取物或PM2.5的有機可溶性提取物。3.試劑盒在對暴露于PM2.5進行鑒別方面的用途，所述試劑盒含有微陣列芯片，所述微陣列芯片上整合有如下微RNA的cDNA：miRNA Mm-miR-1943-3p，所述Mm-miR-1943-3p在miRbase中的微RNA登記號為MIMAT0017342，所述Mm-miR-1943-3p的序列由SEQ.ID.NO：1示出。4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒在對暴露于PM2.5進行鑒別方面的用途，其中，所述試劑盒還包含小鼠肺細胞或組織。5.試劑盒在對暴露于PM2.5進行鑒別方面的用途，所述試劑盒包含與如下微RNA的cDNA或所述cDNA的互補鏈分子互補并能夠擴增所述cDNA的引物：miRNA Mm-miR-1943-3p，所述Mm-miR-1943-3p在miRbase中的微RNA登記號為MIMAT0017342，所述Mm-miR-1943-3p的序...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：柳在泉，鄭勝燦，宋美京，趙允，
申請(專利權(quán))人：韓國科學(xué)技術(shù)研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：韓國;KR