一種提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1熱穩(wěn)定性的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種提高α?L?鼠李糖苷酶r?Rha1熱穩(wěn)定性的方法。以原始型α?L?鼠李糖苷酶r?Rha1（WT）基因為模板，采用易錯PCR方法進行隨機突變，構(gòu)建該酶的突變文庫，并建立了96孔板誘導(dǎo)表達及高通量篩選方法，最終獲得了熱穩(wěn)定性提高的突變體。V529A突變體對試驗使用的金屬離子及效應(yīng)物都具有與WT同樣的耐受性。該突變體V529A具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，同時本發(fā)明專利技術(shù)也成功地構(gòu)建了含上述突變體V529A的重組載體，實現(xiàn)了異源表達，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及基因工程和酶工程的
，尤其涉及一種提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1熱穩(wěn)定性的方法。
技術(shù)介紹
α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))屬于轉(zhuǎn)化糖苷水解酶類，能夠?qū)Ｒ弧⒏咝У厮庠S多糖苷類物質(zhì)如柚皮苷(naringin)、蘆丁(rutin)、橘皮苷(hesperidin)等末端的α-L-鼠李糖基。CAZy(http://www.cazy.org/)數(shù)據(jù)庫中糖苷水解酶的分類依據(jù)是其氨基酸序列的相似性，α-L-鼠李糖苷酶包含在四個糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase family,GH)，分別是GH13、GH28、GH78和GH106。α-L-鼠李糖苷酶的來源非常廣泛，已有動物組織、植物組織和微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶的報道。目前關(guān)于動物組織和植物組織來源的α-L-鼠李糖苷酶的報道相對較少，主要是通過芽孢桿菌、擬桿菌、乳桿菌、鏈霉菌、單胞菌等細菌和黑曲霉、白曲霉、棘孢曲霉、土曲霉、青霉、木霉、酵母、犁頭霉等真菌發(fā)酵來獲取α-L-鼠李糖苷酶。由于黑曲霉是重要的酶制劑生產(chǎn)菌種，其具有重要的糖苷水解酶合成能力，并且是美國食品藥品監(jiān)督管理局允許使用的食品用酶生產(chǎn)菌，本實驗采用基因工程技術(shù)手段對從原始菌株黑曲霉JMU-TS528中克隆得到的α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1進行定向進化。作為一種重要的工業(yè)酶類，α-L-鼠李糖苷酶在飲料加工行業(yè)和藥物制備行業(yè)具有重要的應(yīng)用價值。例如：在飲料加工行業(yè)，該酶可用于對柑橘類果汁進行脫苦處理和澄清處理，消除橙汁中的橘皮苷晶體，增加葡萄酒的香氣，提高蘆筍汁的抗氧化活性；在藥物制備行業(yè)，α-L-鼠李糖苷酶可以用來制備具有抗炎和抗病毒的作用的普魯寧。在工業(yè)生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性越高，其應(yīng)用價值和潛在優(yōu)勢越大。由于大部分天然α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性都存在一定的缺陷，建立一個高效的分子改造的方法提高其熱穩(wěn)定性是極其必要的，為將來開發(fā)更多功能，更優(yōu)質(zhì)的酶打下堅實的理論及實驗基礎(chǔ)。有鑒于此，本專利技術(shù)人研究和設(shè)計了一種提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1熱穩(wěn)定性的方法，本案由此產(chǎn)生。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種熱穩(wěn)定性提高的α-L-鼠李糖苷酶，該α-L-鼠李糖苷酶可用于飲料加工行業(yè)和藥物制備行業(yè)。為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：一種編碼α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基因大小為1 968bp。一種α-L-鼠李糖苷酶V529A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。該蛋白編碼655個氨基酸殘基。一種α-L-鼠李糖苷酶表達載體，含有所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A基因的表達載體pPIC9k-V529A。一種重組α-L-鼠李糖苷酶V529A的制備方法，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A表達載體轉(zhuǎn)化寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組α-L-鼠李糖苷酶V529A。作為實施例的優(yōu)選方式，所述的寄主細胞為畢赤酵母。作為實施例的優(yōu)選方式，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A表達載體轉(zhuǎn)化至寄主細胞畢赤酵母GS115，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，得到可溶性表達的重組α-L-鼠李糖苷酶V529A。作為實施例的優(yōu)選方式，所述的甲醇終濃度為0.5％，誘導(dǎo)溫度為30℃。作為實施例的優(yōu)選方式，α-L-鼠李糖苷酶V529A催化水解的溫度范圍為30℃～80℃，最適溫度為60℃；所述的水解pH范圍為3.0～10.0，最適pH為5.0。最適溫度及最適pH與WT一致。以pNPR為底物，分別將WT及V529A分別放置在60℃，65℃，70℃下進行熱處理，其中，60℃下每2h取樣測定殘余酶活，65℃下每15min取樣測定殘余酶活，70℃下每2min取樣測定殘余酶活，上述酶反應(yīng)在其他反應(yīng)條件固定的情況下測定。初始酶活為沒有經(jīng)過熱處理的酶液測定的酶活。結(jié)果顯示，60℃下V529A的熱穩(wěn)定性比WT提高了1.92h；65℃下V529A的熱穩(wěn)定性比WT提高了25min；70℃下V529A的熱穩(wěn)定性比WT提高了2min。V529A對試驗使用的金屬離子及效應(yīng)物都具有與WT同樣的耐受性。本專利技術(shù)通過易錯PCR隨機突變的方法得到一株α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性提高的突變體V529A，發(fā)現(xiàn)了該突變體具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，可應(yīng)用于飲料加工行業(yè)和藥物制備行業(yè)。同時，本次專利技術(shù)也克隆得到了可以大量表達的工程菌，可實現(xiàn)該熱穩(wěn)定性提高的α-L-鼠李糖苷酶的規(guī)模化生產(chǎn)，為后續(xù)的工業(yè)化應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。附圖說明圖1為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的SDS-PAGE圖。其中，M：分子量標準蛋白；1：純化后的WT；2：純化后的V529A；圖2為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在60℃時的熱穩(wěn)定性曲線圖；圖3為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在65℃時的熱穩(wěn)定性曲線圖；圖4為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在70℃時的熱穩(wěn)定性曲線圖；圖5為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最適反應(yīng)溫度曲線圖；圖6為α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最適反應(yīng)pH曲線圖；圖7為α-L-鼠李糖苷酶WT的pH穩(wěn)定性曲線圖；圖8為α-L-鼠李糖苷酶V529A的pH穩(wěn)定性曲線圖。具體實施方式實施例1：α-L-鼠李糖苷酶基因的獲取接種含有WT(pPIC9K-rha)質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α于含有1mg/mL氨芐抗性的30mL LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16h。使用質(zhì)粒小提取試劑盒(Takara公司)按說明提取WT(pPIC9K-rha)質(zhì)粒。采用EcoR I及Bln I雙酶切驗證。驗證結(jié)果正確后作為易錯PCR的模板。實施例2：α-L-鼠李糖苷酶突變庫的構(gòu)建及篩選將WT基因進行易錯PCR，建立突變庫，96微孔板對該酶進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)過篩選，獲得了熱穩(wěn)性顯著提高的突變體。采用WT(KC750908.1)基因，設(shè)計一對特異性引物：上游引物Q9KF(SEQ ID NO.3)：5′-CCGGAATTCGTACCCTACGAGGAGTACATTCTAG-3′，下游引物Q9KR(SEQ ID NO.4)：5′-CGCCCTAGGTTACACATTCAACCGCCATTTC-3′；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2.5min，35循環(huán)后，72℃延伸7min。使用Takara公司PCR產(chǎn)物柱式回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化。采用酶切克隆的方法構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，即用EcoRI和BlnI雙酶切易錯PCR產(chǎn)物，割膠回收酶切后的片段與同樣經(jīng)EcoRI和BlnI雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K進行連接，采用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中。從氨芐抗性篩選平板挑取單菌落進行菌落PCR鑒定含α-L-鼠李糖苷酶的重組質(zhì)粒，提取PCR陽性菌落的質(zhì)粒進行測序，驗證陽性克隆率及庫容量。將PCR驗證正確的pPIC9K-rhaep的陽性克隆子提取質(zhì)粒并使用SalI將所提質(zhì)粒線性化，采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，涂于MD平板中30℃培養(yǎng)直至長出單菌落，將所有單菌落分別進行保種并用96孔板進行誘導(dǎo)表達及篩選。將其誘導(dǎo)表達后的酶液在65℃下進行熱處理，篩選得到1株熱穩(wěn)定性提高的突變體，本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種編碼α?L?鼠李糖苷酶V529A的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種編碼α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一種α-L-鼠李糖苷酶V529A，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一種α-L-鼠李糖苷酶表達載體，其特征在于：含有權(quán)利要求1所述的編碼α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因的表達載體pPIC9k-V529A。4.一種α-L-鼠李糖苷酶V529A的制備方法，其特征在于：包括采用權(quán)利要求3所述的α-L-鼠李糖苷酶表達載體轉(zhuǎn)化寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得α-L-鼠李糖苷酶V529A。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種α-L-鼠李糖苷酶V529A的制備方法，其特征在于：所述的寄主細胞為畢赤酵母。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種α-L-鼠李糖苷酶V529A的制備方法，其特征在于：包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶表達載體轉(zhuǎn)化至寄主細胞畢赤酵母GS115，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，得到可溶性表達的重組α-L-鼠李糖苷酶。7.根據(jù)權(quán)利要求...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李利君，吳喆瑜，倪輝，楊遠帆，于越，朱艷冰，姜澤東，肖安風(fēng)，
申請(專利權(quán))人：集美大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：福建;35