一種Haliscomenobacter?hydrossis絲狀菌群PCR試驗特異性引物和方法，涉及污水生物處理領域。該特異性引物的序列為正向引物(序列為5’?AATCAGGTTGAGGTAGGC?3’)；反向引物(序列5’?CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT?3’)。PCR反應體系：2倍濃度的Taq?PreMix試劑10μl；DNA模板0.5?1μl；正向引物和反向引物(濃度為10μm/L)各0.5?1μl；加滅菌水到總體積20μl。按上述引物、反應體系進行PCR反應，并將擴增產物在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳中跑膠，得到分離良好的DNA亮條帶(圖1)。本發明專利技術對H.hydrossis絲狀菌群特異性高，能夠更高效地進行PCR試驗，方便后續對其定性和定量分析，同時只需對PCR產物進行單向測序，省去了雙向測序及拼接等操作步驟，節省測序費用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及污水生物處理領域，提供一種Haliscomenobacter hydrossis(H.hydrossis)絲狀菌群PCR引物和方法，該引物對H.hydrossis絲狀菌群特異性高，能夠高效準確地進行H.hydrossis絲狀菌群的PCR試驗，可以對后續H.hydrossis絲狀菌群進行準確定性和定量，同時只需對PCR產物進行單向測序，省去了雙向測序及后續序列拼接等操作步驟，節省測序費用。
技術介紹
目前，活性污泥法污水處理廠及活性污泥法工藝時常發生以H.hydrossis絲狀菌引起的污泥膨脹問題。目前對H.hydrossis絲狀菌群的鑒定通常采用較早的Eikelboom絲狀菌鑒定方法及熒光原位雜交(FISH)技術。隨著PCR和實時定量PCR試驗技術的發展，給H.hydrossis絲狀菌群的鑒定及定量提供了新的技術方法。然而，目前針對H.hydrossis絲狀菌群進行PCR試驗的引物稀少，且現有引物的特異性不是很高，在進行PCR過程中同時可以擴增大量非目的菌種，對后續的序列分析帶來不便。此外現有H.hydrossis絲狀菌的引物PCR產物序列較長，序列測序過程同時需要正向和反向測序，后期再進行拼接才能完成，測序費用較高。因此，目前缺乏針對H.hydrossis絲狀菌群進行PCR試驗簡便且特異性高的引物和方法，對H.hydrossis絲狀菌群進行高效準確的PCR試驗分析，以便對H.hydrossis絲狀菌序列進行簡便準確測序分析，以便后期對其菌群進行準確定性和定量。
技術實現思路
針對上述研究的不足之處，本專利技術提供針對H.hydrossis絲狀菌群PCR試驗特異性引物和方法，對H.hydrossis絲狀菌群特異性高，能夠高效地進行H.hydrossis絲狀菌群的PCR試驗，同時只需對PCR產物進行單向測序，節省測序費用。1.一種Haliscomenobacter hydrossis絲狀菌群PCR引物，其特征在于：正向引物序列為5’-AATCAGGTTGAGGTAGGC-3’；反向引物序列為5’-CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT-3’。2.包含所述引物的試劑盒。3.使用所述引物進行PCR擴增的方法，其特征在于：包括變性、復性和延伸。聚合酶鏈式反應方法的反應體系：2倍濃度的Taq PreMix試劑10μl；DNA模板0.5-1μl；濃度為10μm/L的正向引物和濃度為10μm/L的反向引物各0.5-1μl；加滅菌水到總體積20μl。聚合酶鏈式反應的反應程序：①1個循環：溫度為94℃時間為2-5min；②30個循環：依次為變性溫度94℃，時間20-30s；復性溫度50-55℃，時間30s-1min；延伸溫度72℃，時間2min；③1個循環：溫度72℃，時間5-10min。與現有引物相比，本專利技術具有以下優點：(1)本專利技術提供的H.hydrossis絲狀菌群PCR試驗引物和方法特異性高，能高效地進行H.hydrossis絲狀菌PCR試驗。(2)本專利技術提供的H.hydrossis絲狀菌群PCR試驗特異性引物可以準確地進行后續H.hydrossis絲狀菌群定性及定量分析。(3)本專利技術提供的H.hydrossis絲狀菌群引物的理論PCR產物只需進行單向測序分析，省去了雙向測序及拼接等操作步驟，大大節省了測序分析費用。附圖說明圖1為本專利技術NCBI數據庫中搜索的H.hydrossis絲狀菌基因序列圖2為本專利技術特異性引物在NCBI數據庫中特異性比對分析結果圖圖3為本專利技術H.hydrossis絲狀菌群PCR產物1.5％瓊脂糖凝膠電泳圖具體實施方式下面結合附圖和具體實施方法對本專利技術作進一步詳細說明，本專利技術提供的H.hydrossis絲狀菌群特異性引物和方法包括以下內容：(1)NCBI庫里查找H.hydrossis絲狀菌序列，圖1；(2)對H.hydrossis絲狀菌群各序列與其他菌序列進行比對分析，選擇設計其特異性引物的模板序列：NR_074420.1、M58790.2和NR_042316.1(NCBI檢索號)；(3)根據引物設計的一般原則(引物長度、引物GC含量、引物Tm、引物3’端和5′端注意事項、引物序列與模板序列組成的相似性、ΔG值等)進行引物的設計，主要進行設計引物類型、搜索模式、前后引物搜索范圍、產物大小、引物長度等參數設置；(4)得到前后引物后分析其有無①Hairpin:引物自身是否會形成發夾結構；②Dimer:同一種引物是否會形成二聚體；③False primiring:引物在待擴增序列中其他位置是否有配對；④Cross Dimer:正向與反向引物間是否會形成二聚體，同時查看引物各指標是否符合引物設計原則；(5)按需要對設計的引物進行結合位點、酶切位點等相應編輯；(6)將得到的引物與作為設計模板的序列輸入NCBI庫進行引物特異性比對，分析其結果(圖2)，發現此引物對H.hydrossis絲狀菌群特異性高。(7)準備200μl離心管，依次加入2倍濃度的Taq PreMix試劑10μl；DNA模板1μl；正向引物和反向引物(10μm/L)各0.5μl；加滅菌水到總體積20μl；同時用滅菌水代替DNA模板進行陰性對照試驗。(8)對PCR儀設定反應程序：①1個循環：溫度為94℃時間為2min。②30個循環：依次為變性溫度94℃，時間30s；復性溫度51℃，時間40s；延伸溫度72℃，時間2min。③1個循環：溫度72℃，時間10min。(9)將PCR擴增產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳試驗，觀察目的DNA條帶的分離效果良好(圖3)，進行下一步。(10)將目的條帶進行凝膠回收和連接轉化后送測序公司測序，將測序序列與目的菌種的DNA序列對比分析，發現與目的菌群序列一致。以上所述僅為本專利技術的較佳實施例，并不用以限制本專利技術，凡在本專利技術的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本專利技術的保護范圍之內。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種Haliscomenobacter?hydrossis絲狀菌群PCR引物，其特征在于：正向引物序列為5’?AATCAGGTTGAGGTAGGC?3’；反向引物序列為5’?CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT?3’。
【技術特征摘要】
1.一種Haliscomenobacter hydrossis絲狀菌群PCR引物，其特征在于：正向引物序列為5’-AATCAGGTTGAGGTAGGC-3’；反向引物序列為5’-CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT-3’。2.包含如權利要求1所述引物的試劑盒。3.使用如權利要求1所述引物進行PCR擴增的方法，其特征在于：包括變性、復性和延伸。4.如權利要求3所述方法，其特征在于：聚合酶鏈式反應方法的反應體系：2倍濃度的Taq ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：焦二龍，高春娣，田燁，李任飛，樊士信，彭永臻，
申請(專利權)人：北京工業大學，
類型：發明
國別省市：北京;11
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