一種快速測定微藻脂質含量的方法技術

本發明專利技術公開了一種快速測定微藻脂質含量的方法，屬于生物質能源技術領域。本發明專利技術的方法是在約1mL藻液中加入50μg/mL?1?丁基?3?甲基咪唑氯鹽和1μg/mL3?PeDPP，溫浴后使用流式細胞儀分析。本發明專利技術的方法，不需提取細胞內的脂質即可測定脂質的成分及含量，解決了現有方法需樣量大、操作步驟多和耗時長的技術問題。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種快速測定微藻脂質含量的方法，屬于生物質能源

技術介紹
生物柴油是以植物和動物脂肪酸為原料得到的一種生物燃料，它具備與石化柴油相近的性能，且具有優良的環保特性、良好的燃料性能及可再生性。由于我國耕地面積有限，因此僅靠種植木本植物滿足柴油消耗是遠遠不夠的。微藻作為光合自養模式生存的微生物，生存環境多樣，種類繁多，光合效率、生長速度以及含油率遠遠高于其他高含油木本植物。因此，微藻脂質是具有廣闊前景的新型脂質資源，被認為是最有潛力替代石油的生物質資源。測定微藻中脂質含量的傳統方法主要為重量法，其原理為先將微藻破碎，然后用非極性溶劑抽提，最后稱重得到脂質含量。重量法需要大量的藻液，且操作復雜。流式細胞術是細胞和分子生物學、生物技術、單克隆抗體技術、激光技術、光電子物理、熒光化學、流體力學、計算機技術等多學科領域共同發展的結晶，可以用熒光染料或者熒光素偶聯抗體作為輔助試劑，對獨立狀態的細胞或生物顆粒(細胞直徑為0.2-150μm)進行多參數、快速、準確、客觀的定量分析。目前流式細胞術中常用于檢測細胞內油脂的熒光染料為尼羅紅。在一定條件下對微藻細胞進行染色后，用流式細胞儀檢測細胞在黃色光譜范圍通道和紅色光譜范圍通道的熒光強度，分別與細胞內的中性油脂和極性油脂的含量成正比。然而，紅色光譜范圍的熒光強度容易受微藻中其它自發熒光信號干擾，因此，需要以利用二甲基亞砜作為染色載體，增加細胞膜的通透性以提高尼羅紅進入細胞內的量，從而提高熒光強度，但二甲基亞砜具有揮發性和毒性，對操作者的健康存在一定威脅，加入藻液后會對藻細胞產生毒害作用。目前報道了各種不同條件(二甲基亞砜濃度、染色時間、染色溫度等)的染色方法，但仍然普遍存在著染色不完全、熒光峰重疊、與油脂絕對含量對應關系的線性較差等缺點。文獻報道的另一種用于檢測油脂的染料為BODIPY 505/515(4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene)，它在515nm有較窄的發射光譜，可獲得分離程度較高的峰，但也需以存在著需使用二甲基亞砜、染色不完全的缺點，且其本身的背景熒光強度過大導致靈敏度較低，目前尚未建立與油脂絕對含量對應關系線性良好的方法。綜上所述，傳統的重量法存在著操作復雜、耗時長、無法區分中性脂質和極性脂質的問題，而已報道的基于流式細胞術的方法存在著威脅操作者健康、損害藻細胞、所得到的油脂絕對含量不準確等缺點。因此，建立綠色環保、快速、準確的檢測細胞內脂質含量的方法，對促進微藻生物柴油行業的發展有重要意義。
技術實現思路
為了解決上述問題，本專利技術的目的是提供一種快速測定微藻脂質含量的方法，它對環境友好、不損害藻細胞，只需要很少的藻液，操作簡單，靈敏度高，結果較為準確。本專利技術的測定微藻脂質的方法，是在微藻藻液中添加1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽增加細胞膜的通透性，并用3-perylene diphenylphosphine(3-PeDPP)染色，然后使用流式細胞儀進行分析。所述方法是：(1)取5份或5份以上脂質含量不同的同種微藻藻液，在藻液中加入1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽，并用3-PeDPP染色；(2)使用流式細胞儀的FL1(500/50)通道收集多個藻細胞的熒光強度，計算平均熒光強度MFI；(3)建立實測脂質含量與平均熒光強度的關系模型：測定5份或5份以上微藻中的脂質含量C，與MFI擬合得到關系模型(公式(I))，得到模型中a、b具體數值：C＝a×MFI+b 公式(I)(4)在待測的同種微藻的藻液中加入1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽，并用3-PeDPP染色，采用與(2)相同的條件，在FL1(500/50)通道下，測定得到多個藻細胞的平均熒光強度MFI，將MFI代入公式(I)中，即可得到待測微藻細胞的脂質含量。在本專利技術的一種實施方式中，所述(1)的藻液中1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽和3-PeDPP染料的濃度分別為50μg/mL和1μg/mL，暗室中置于40℃水浴中15min。在本專利技術的一種實施方式中，所述(1)是取微藻1ml藻液過300目篩后置于樣品管中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽(增加細胞膜的通透性)和3-PeDPP(染色)。在本專利技術的一種實施方式中，所述(1)的藻液中的藻密度為105-106/ml。在本專利技術的一種實施方式中，所述(2)中流式細胞儀分析時的流速為60μL/min。在本專利技術的一種實施方式中，所述(2)中收集多個藻細胞的熒光強度，是指收集100個以上，優選地200個以上、500個以上，更優選地1000個以上、10000個以上或者10000個以上的藻細胞的熒光強度。在本專利技術的一種實施方式中，所述(2)中收集10000個以上的藻細胞的熒光強度。收集測定的越多，數據可靠性越強。在本專利技術的一種實施方式中，所述脂質含量，是指脂質占藻干重的質量百分比(比如測100g藻的總脂質含量，含量為1％，那么脂質就是1g)。在本專利技術的一種實施方式中，所述(3)中測定微藻中的脂質含量C的值，是按照重量法測定得到的，先將微藻破碎，然后用非極性溶劑抽提，最后稱重得到脂質含量。在本專利技術的一種實施方式中，所述(3)中測定微藻中的脂質含量C的值，按下列方法進行：稱取對應藻液干燥后的藻粉，每種樣品約50mg，研磨破壁后轉移至帶蓋離心管中，加入3ml體積比為1:2的三氯甲烷-甲醇溶液，漩渦震蕩2min，加入1ml三氯甲烷，漩渦震蕩2min后1000r/min離心，收集上清液；再重復提取2次，合并上清液；再加入體積比為2:2:1.8的三氯甲烷-甲醇-水，震蕩混勻后2000r/min離心，取下層有機相氮氣吹干至恒重。在本專利技術的一種實施方式中，所述(4)的脂質含量由FL1(500/50)通道的平均熒光強度來計算。在本專利技術的一種實施方式中，所述(4)中的微藻的脂質含量是指總脂的質量百分比含量。本專利技術所述的微藻為細胞直徑在0.2-150μm、不團聚生長的綠藻、紅藻、黃藻、硅藻、褐藻或金藻。所述微藻，可以是小球藻、月牙藻、斜生柵藻等。本專利技術的有益效果：(1)只需要很少的藻液，操作簡單，靈敏度高，操作方便快捷。(2)不需使用對人體和藻細胞有毒害作用的試劑，綠色環保。(3)細胞染色充分，熒光強度和脂質含量的線性關系可達到0.9438。附圖說明圖1：實測脂質含量與平均熒光強度的關系模型。具體實施方式實施例1：檢測普通小球藻的脂質含量。取1mL藻液過300目篩后加入50μg/mL 1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽和1μg/mL 3-PeDPP，暗室中置于40℃水浴中15min，使用流式細胞儀進行分析。使用流式細胞儀的FL1(500/50)通道分別收集5份藻液中10000個藻細胞的熒光強度，其平均熒光強度MFI分別為351.0608，178.81069，404.77274，270.32026和94.8327；經重量法測定的5份小球藻中的脂質含量分別為32.01％，27.30％，36.58％，30.87％和20.31％。擬合得到模型參數a、b的具體數值，分別是0.0469和17.227，線性相關系數為0.9704。故，普通小球藻的脂質含量計算公式如下：C/％＝0.0469×MFI+17本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種快速測定微藻脂質的方法，其特征在于，所述方法是：(1)取5份或5份以上脂質含量不同的同種微藻藻液，在藻液中加入1?丁基?3?甲基咪唑氯鹽，并用3?perylene?diphenylphosphine(3?PeDPP)染色；(2)使用流式細胞儀的FL1(500/50)通道收集多個藻細胞的熒光強度，平均熒光強度為MFI；(3)建立實測脂質含量C與平均熒光強度的關系模型，得到模型中a、b具體數值：C＝a×MFI+b???????????公式(I)；(4)在待測的同種微藻的藻液中加入1?丁基?3?甲基咪唑氯鹽，并用3?PeDPP染色，采用與(2)相同的條件，在FL1(500/50)通道下，測定得到多個藻細胞的平均熒光強度MFI，將MFI代入公式(I)中，即可得到待測微藻的脂質含量。

【技術特征摘要】
1.一種快速測定微藻脂質的方法，其特征在于，所述方法是：(1)取5份或5份以上脂質含量不同的同種微藻藻液，在藻液中加入1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽，并用3-perylene diphenylphosphine(3-PeDPP)染色；(2)使用流式細胞儀的FL1(500/50)通道收集多個藻細胞的熒光強度，平均熒光強度為MFI；(3)建立實測脂質含量C與平均熒光強度的關系模型，得到模型中a、b具體數值：C＝a×MFI+b 公式(I)；(4)在待測的同種微藻的藻液中加入1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽，并用3-PeDPP染色，采用與(2)相同的條件，在FL1(500/50)通道下，測定得到多個藻細胞的平均熒光強度MFI，將MFI代入公式(I)中，即可得到待測微藻的脂質含量。2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，所述(1)的藻液中1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽和3-PeDPP染料的濃度分...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄧蕓，阮文權，謝利娟，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32