核酸檢測(cè)方法和試劑盒技術(shù)

提供了用于檢測(cè)靶標(biāo)核酸的方法和試劑盒，其中擴(kuò)增的核酸與例如順磁性珠的顆粒結(jié)合形成絮凝型復(fù)合物，所述絮凝型復(fù)合物可以通過視覺觀察檢測(cè)。可以被檢測(cè)的核酸樣本的體積低至幾微升。該方法可以應(yīng)用于實(shí)地或照護(hù)點(diǎn)診斷，用于快速確定靶標(biāo)核酸的存在或不存在。還可以確定靶標(biāo)核酸的甲基化狀態(tài)。所述方法和試劑盒具有在植物和動(dòng)物中檢測(cè)疾病、環(huán)境檢測(cè)以及食品和其它可食用產(chǎn)品污染檢測(cè)的普遍適用性。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及核酸檢測(cè)。更具體地，本專利技術(shù)涉及使用相對(duì)小體積的核酸樣本快速檢測(cè)核酸，其中通過視覺觀察檢測(cè)核酸。
技術(shù)介紹
高度需求在現(xiàn)場(chǎng)或照護(hù)點(diǎn)(point-of-care，POC)以最低限度的設(shè)備進(jìn)行的、快速且低成本的核酸生物測(cè)定。雖然為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)進(jìn)行了很多嘗試，目前在實(shí)踐中沒有實(shí)現(xiàn)。已知用于檢測(cè)疾病DNA生物標(biāo)記物的技術(shù)和方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)1。然而，這些方法需要在熱循環(huán)儀上進(jìn)行熱循環(huán)以實(shí)現(xiàn)快速指數(shù)DNA擴(kuò)增，且因此不適合用于實(shí)地(field)或現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。但是，最近已經(jīng)出現(xiàn)多種用以克服這種限制的等溫的DNA擴(kuò)增方法2,3。例如，為實(shí)現(xiàn)POC應(yīng)用，通過重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)4或依賴解旋酶擴(kuò)增(HDA)5擴(kuò)增的病原體DNA已被調(diào)整而用于在橫向流條和便攜式熒光針上進(jìn)行檢測(cè)6-9。然而，這種讀取方法雖然方便，但仍然依賴于使用相對(duì)復(fù)雜的設(shè)備，以及可能對(duì)于全世界的操作者仍然存在資金障礙。此外，在實(shí)地進(jìn)行采樣，即使有的話，也極少被討論。具體的，使用最少的人操作和現(xiàn)場(chǎng)設(shè)施始終產(chǎn)生固定量的樣本DNA用于下游應(yīng)用。這個(gè)重要問題對(duì)任何測(cè)定的性能具有顯著的影響。因此，用于現(xiàn)場(chǎng)的核酸檢測(cè)應(yīng)用的實(shí)地即用(field-ready)綜合測(cè)定仍然是難以實(shí)現(xiàn)的愿望。一個(gè)可以受益于低成本現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定的領(lǐng)域是在農(nóng)業(yè)中。農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)是世界經(jīng)濟(jì)主要的貢獻(xiàn)者(估計(jì)每年1.5萬億美元)。然而，農(nóng)作物疾病爆發(fā)是在依賴農(nóng)業(yè)的經(jīng)濟(jì)中的主要問題，特別是在發(fā)展中國(guó)家中，估計(jì)每年農(nóng)作物損失2200億美元10。目前，一旦疾病爆發(fā)傳播超過某個(gè)閾值，則沒有辦法挽救受害的農(nóng)作物。控制疾病爆發(fā)的理想的方法是通過在其傳播之前在實(shí)地早期檢測(cè)。農(nóng)作物疾病管理的有效性高度依賴于診斷方法的快捷性、敏感性和特異性。傳統(tǒng)上疾病鑒定是通過視覺檢查受影響的植物組織的疾病表型而進(jìn)行的。然而，這需要有經(jīng)驗(yàn)的植物病理學(xué)家并且是相對(duì)主觀的11。許多敏感的用以提高疾病鑒定診斷的方法，例如已經(jīng)開發(fā)了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)12,13、免疫印跡14,15、免疫熒光測(cè)試16和基于PCR測(cè)定的多種迭代(iterations)17,18用以促進(jìn)疾病診斷。然而，所有這些檢測(cè)方法需要昂貴且復(fù)雜的設(shè)備，并且僅能在實(shí)驗(yàn)室中通過訓(xùn)練有素的技術(shù)人員進(jìn)行。此外，缺乏快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)導(dǎo)致部署疾病控制措施的延遲，反過來導(dǎo)致農(nóng)作物進(jìn)一步損失。因此，有必要開發(fā)新的可在實(shí)地的應(yīng)用的疾病診斷技術(shù)，不需要使用專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。此外，這些技術(shù)應(yīng)該是廉價(jià)的、敏感的、可重復(fù)的，并且不需要專業(yè)人員，其最終目標(biāo)是允許每個(gè)農(nóng)民檢測(cè)他或她自己的農(nóng)作物。相似地，早期檢測(cè)農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物病原體對(duì)避免疾病的傳播是至關(guān)重要的，尤其是在使用密集生產(chǎn)方法的現(xiàn)代農(nóng)場(chǎng)中。此外，早期診斷和檢測(cè)人疾病，以及不依賴于復(fù)雜的技術(shù)需求的可用的POC方法，在發(fā)達(dá)以及發(fā)展中國(guó)家中，特別是在自然災(zāi)害情況(例如臺(tái)風(fēng)、海嘯或地震)后，可以挽救無數(shù)生命。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)人意識(shí)到對(duì)簡(jiǎn)單的、可靠的、快速的和廉價(jià)的核酸檢測(cè)方法的需求。因此，本專利技術(shù)廣泛的提供了一種用于以相對(duì)小的樣本大小快速檢測(cè)核酸的方法和試劑盒，其中核酸的存在和/或不存在可以通過視覺檢測(cè)到。本方法的優(yōu)勢(shì)在于，以優(yōu)選的形式，其排除了對(duì)設(shè)備的需求，例如離心機(jī)、熱循環(huán)儀和分光光度計(jì)，所有這些需要利用主電力(main electricity)或電池形式的能。在具體的實(shí)施方案中，所述方法或試劑盒可以用于檢測(cè)植物、人和非人動(dòng)物的一種或多種非致病性或致病性生物。在第一方面，本專利技術(shù)提供了一種檢測(cè)核酸的方法，所述方法包括使分離的核酸與顆粒結(jié)合的步驟，其中所述分離的核酸與所述顆粒能夠形成可以通過視覺觀察而被檢測(cè)的復(fù)合物。合適地，與在沒有或相對(duì)低的量或濃度的核酸中觀察到的相比，通過存在或相對(duì)增加水平的可視覺檢測(cè)的復(fù)合物指示核酸的存在或相對(duì)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述顆粒是順磁性顆粒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒是SPRI顆粒。優(yōu)選地，所述顆粒在pH<7中與分離的核酸形成復(fù)合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH在約3.6-5.5的范圍，或者更優(yōu)選地約pH 4.4。根據(jù)本實(shí)施方案，通過核酸-顆粒復(fù)合物的絮凝形成復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可以包括使用著色劑以促進(jìn)、幫助或提高核酸-顆粒復(fù)合物的視覺檢測(cè)。合適地，所述著色劑結(jié)合核酸，并且提供在視覺范圍的波長(zhǎng)(即約390nm至約700nm)的光學(xué)特征(signature)。光學(xué)特征可以包括在視覺范圍內(nèi)的波長(zhǎng)的光(包括磷光和/或熒光)的吸收或發(fā)射。合適地，分離的核酸是通過在核酸樣本中存在的模板核酸的核酸序列擴(kuò)增獲得的。典型地，模板核酸的核酸序列擴(kuò)增包括一種或多種引物，其至少部分特異于模板核酸。在優(yōu)選的形式中，通過等溫核酸序列擴(kuò)增獲得分離的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，等溫核酸序列擴(kuò)增是重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，等溫核酸序列擴(kuò)增是滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。合適地，模板核酸存在于核酸樣本，所述核酸樣本可從任何生物或其他來源的核酸獲得。在優(yōu)選的形式中，模板核酸通過以下一個(gè)或多個(gè)步驟獲得，包括：(a)包含靶標(biāo)核酸的核酸樣本的重力過濾；(b)使靶標(biāo)核酸與顆粒結(jié)合；和(c)從顆粒洗脫靶標(biāo)核酸。在典型實(shí)施方案中，在步驟(b)和/或步驟(c)中靶標(biāo)核酸的體積是約10μL。在另一方面，本專利技術(shù)提供了一種用于檢測(cè)核酸的試劑盒，所述試劑盒包含能夠與分離的核酸形成復(fù)合物的顆粒，所述復(fù)合物能夠通過視覺觀察檢測(cè)。所述試劑盒可進(jìn)一步包含以下的一種或多種：用于核酸序列擴(kuò)增的核酸聚合酶；一種或多種用于核酸序列擴(kuò)增的引物；磁體；用于核酸提取的試劑；過濾器；著色劑；和/或一種或多種反應(yīng)容器。所述方法和/或試劑盒可以用于檢測(cè)任何來源的核酸，包括人和其它動(dòng)物、植物、致病性和非致病性生物，包括原生生物、古菌、細(xì)菌、病毒、酵母、真菌、蠕蟲和其它無脊椎動(dòng)物，但不限于此。在具體的實(shí)施方案中，所述方法和試劑盒可以用于檢測(cè)核酸，所述核酸與人、非人動(dòng)物和植物的疾病和病癥有關(guān)，與環(huán)境檢測(cè)有關(guān)，與食物、飲料和其它消費(fèi)品的檢測(cè)有關(guān)，以及與法醫(yī)分析有關(guān)，但不限于此。在本說明書中，除非另有指示，所使用的“包含(comprise)”、“包括(comprises)”和“含有(comprising)”是包含地而不是排他地，所以，闡述的整數(shù)或整數(shù)的組可以包括一個(gè)或多個(gè)其它未闡述的整數(shù)或整數(shù)的組。附圖說明此處，參考以下附圖描述本專利技術(shù)的非限制性的實(shí)施方案。圖1：?jiǎn)蔚位蚪M學(xué)測(cè)定的示意圖。在現(xiàn)場(chǎng)通過簡(jiǎn)單的核酸提取方法將感興趣的樣本加工至窄的濃度范圍。然后檢測(cè)病原體核酸，并通過重組酶聚合酶擴(kuò)增等溫地進(jìn)行擴(kuò)增。最后通過新的絮凝測(cè)定可視化測(cè)定結(jié)果。圖2：精確的核酸提取過程。(A)提取過程的圖示。圖片顯示用于提取的可能的樣本，使用一次性研缽和杵手工浸漬(maceration)樣本，并且使用普通的過濾移液器頭清除裂解物的細(xì)胞碎片。(B)四個(gè)獨(dú)立提取的DNA樣本的凝膠電泳。高分子量表明提取的DNA的良好的完整性。(C)提取的核酸的光譜分析。上面：DNA，下面：RNA。圖3：絮凝測(cè)定。(A)DNA介導(dǎo)的SPRI顆粒的絮凝的概念表征。(B)過量的引物不介導(dǎo)絮凝。(C)僅10％或更高的擴(kuò)增導(dǎo)致絮凝。(D)擴(kuò)增的DNA的截?cái)酀舛纫蕾嚤疚臋n來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)核酸的方法，所述方法包括使分離的核酸與顆粒結(jié)合的步驟，其中所述分離的核酸與所述顆粒能夠形成可以通過視覺觀察檢測(cè)的復(fù)合物。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】2013.12.23 AU 20139050521.一種檢測(cè)核酸的方法，所述方法包括使分離的核酸與顆粒結(jié)合的步驟，其中所述分離的核酸與所述顆粒能夠形成可以通過視覺觀察檢測(cè)的復(fù)合物。2.一種用于檢測(cè)核酸的試劑盒，所述試劑盒包含能夠與分離的核酸形成復(fù)合物的顆粒，所述復(fù)合物能夠通過視覺觀察被檢測(cè)到。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含以下的一種或多種：用于核酸序列擴(kuò)增的酶；一種或多種用于核酸序列擴(kuò)增的引物；磁體；一種或多種用于核酸提取的試劑；過濾器；和/或一種或多種反應(yīng)容器。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法或者權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述復(fù)合物是通過核酸與顆粒絮凝形成的。5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒，其中與在沒有或相對(duì)低的量或濃度的核酸中觀察到的絮凝相比，通過沒有或相對(duì)減少的絮凝指示核酸的存在或相對(duì)量。6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒，其中所述顆粒是順磁性顆粒。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法或試劑盒，其中所述順磁性顆粒是SPRI顆粒。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法或試劑盒，其中在絮凝緩沖液中發(fā)生絮凝。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法或試劑盒，其中所述絮凝緩沖液是pH(i)低于7；(ii)約pH 3.6-5.5；或者(iii)約pH 4.4。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法或試劑盒，其中所述絮凝緩沖液的pH是絮凝后半定量滴定的。11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒，其進(jìn)一步包含著色劑，用以促進(jìn)、幫助或提高核酸：顆粒復(fù)合物的視覺檢測(cè)。12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒，其中所述核酸是靶標(biāo)核酸通過核酸序列擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法或試劑盒，其中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行核酸序列擴(kuò)增。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法或試劑盒，其中通過等溫核酸序列擴(kuò)增進(jìn)行核酸序列擴(kuò)增。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法或試劑盒，其中等溫核酸序列擴(kuò)增是重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)或滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。16.根據(jù)權(quán)利要求12至15任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增自靶標(biāo)核酸，所述靶標(biāo)核酸通過以下連...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：M·特勞，E·威，J·R·博泰拉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：昆士蘭大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：澳大利亞;AU