具有改進的基因表達能力的表達載體制造技術

本發明專利技術涉及具有改進的基因表達能力的表達載體、由所述表達載體轉化的細胞，以及通過使用所述細胞來大量生產靶蛋白的方法。與典型的動物細胞表達載體相比，根據本發明專利技術的表達載體顯示出更優異的基因表達能力，因此，可以顯著提高異源基因的蛋白質表達。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于改進基因表達的表達載體、由所述表達載體轉化的細胞以及通過使用所述經轉化的細胞來大量生產靶蛋白的方法。
技術介紹
在大多數情況下，已經通過使用動物細胞進行了治療性重組蛋白和抗體的生產，并且正在努力提高生產效率。例如，在無血清培養基中預適應的懸浮宿主細胞系已被用于快速選擇高生產細胞系(producer cell line)。此外，已經不斷開發高表達載體和高生產細胞系以消除或縮短基因擴增所需的時間。還在努力地開發一種通過在細胞系的初始選擇中使用自動化的細胞選擇裝置的有效方法。高生產細胞系顯示出30至80pcd的表達水平(甚至是在沒有基因擴增時)，并且高生產細胞系可通過使用基于基質附著區(matrix attachment region，MAR)或類似于MAR的普遍存在的染色質開放元件(ubiquitous chromatin opening element，UCOE)的高表達載體而在4個月內制備。最近的研究表明，載體優化對于在六個月內實現3g/L至5g/L的抗體生產率是必需的。最近，對MAR元件(例如雙-MAR、多-MAR、反式-MAR等)的優化暗示了生產率提高的可能性，但是仍持續需要可通過引入5’UTR或內含子元件來獲得具有改善的生產效率的穩定載體。
技術實現思路
因此，本專利技術的一個目的是提供用于大量表達和生產靶蛋白的表達載體。本專利技術的另一個目的是提供由上述表達載體轉化的細胞。本專利技術的再一個目的是提供通過使用所述經轉化的細胞來大量生產靶蛋白的方法。為了實現如上所述的本專利技術的一個目的，提供了包含可操作地連接的猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)啟動子、支架附著區(scaffold attachment region，SAR)或基質附著區(MAR)元件以及嵌合內含子的表達載體。為了實現如上所述的本專利技術的另一個目的，提供了由上述表達載體轉化的細胞。為了實現如上所述的本專利技術的再一個目的，提供了通過培養所述經轉化的細胞來大量生產靶蛋白的方法。與常規表達載體相比，根據本專利技術的表達載體顯示出優異的基因表達，因此，可以顯著提高外源基因的蛋白質表達。附圖說明通過本專利技術的以下描述結合所附附圖，本專利技術的上述目的和特征以及其他目的和特征將變得明顯。圖1示出了關于MAR候選元件的螢光素酶(luciferase)載體的示意圖。圖2示出了MAR候選元件的螢光素酶表達結果。圖3示出了比較啟動子測試的螢光素酶表達結果。圖4示出了關于LCR(基因座控制區(locus control region))候選元件的螢光素酶載體的示意圖。圖5示出了用于制備Alb E64×4LCR元件的PCR策略。圖6和7示出了LCR候選元件的螢光素酶表達結果。圖8示出了dCFH(人補體因子H的缺失形式(deletion form of human complementfactor H))的制備過程。圖9示出了dCFH在CHO-S細胞中的表達水平。圖10示出了dCFH在293-F細胞中的表達水平。圖11示出了dCFH在CHO-DG44穩定細胞中的表達水平。圖12和13分別示出了FIX表達載體組1的示意圖及其表達結果。圖14和15分別示出了FIX表達載體組2的示意圖及其表達結果。圖16示出了嘌呤霉素(Puromycin)表達系統的限制性酶圖譜。圖17示出了一對新載體pMS-P-MCS和pMS-D-MC的結構。圖18A和18B分別示出了用于ER2抗體表達的第一對新載體(“新載體對I”)(pMS-P-ER2LC和pMS-D-ER2HC)以及一對MAR載體(pMSGneo-ER2LC和pMSGneo-ER2HC)的結構。圖19示出了用于ER2抗體表達的第二對新載體(“新載體對II”)(pMSI-P-ER2LC和pMSI-D-ER2HC)的結構。圖20A和20B分別示出了一對啟動子載體(pS)(pS-P-ER2LC和pS-D-ER2HC)以及一對內含子載體(pSI-P-ER2LC和pSI-D-ER2HC)的結構。圖21A和21B分別示出了在CHO貼壁細胞CHO-K1和DG44中ER2抗體的表達水平。具體實施方式在本專利技術中，為了制備用于在CHO(中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary))細胞等中表達外源基因之具有改進生產效率的穩定表達載體，在多種MAR元件、支架附著區(scaffoId attachment region，SAR)元件、基因座控制區(locus control region，LCR)和內含子元件中鑒定出可提高基因表達水平的元件。因此，本專利技術提供了包含可操作地連接的SV40(猿猴病毒40(simian virus 40))啟動子、支架附著區(SAR)或基質附著區(MAR)元件以及嵌合內含子的表達載體。如本文所使用的術語“啟動子”是指編碼區上游(upstream)的非翻譯核酸序列，其包含聚合酶結合位點并且對于下游基因具有mRNA轉錄起始活性。具體地，“啟動子”包含通過RNA聚合酶來起始轉錄的TATA盒或TATA樣區域；但并不限于圍繞其的區域；并且可包含對于與除RNA聚合酶之外的蛋白質締合以調控表達而言必需的區域。在本專利技術中，啟動子可包括SV40啟動子或其變體，優選由SEQ ID NO：12表示的SV40啟動子。啟動子變體是指這樣的變體，其中啟動子序列的某一部分通過添加、缺失或替換而被修飾以提高基因表達。根據本專利技術的一個實施方案，與CMV啟動子相比，本專利技術的使用SV40啟動子的表達載體顯示出約4倍的表達提高(參見實施例1-1)。此外，這樣的啟動子與為外源基因的靶基因可操作地連接；如本文所使用的“可操作地連接(operably linked)”意指調控靶基因表達的核酸序列和編碼靶蛋白的核酸序列功能性連接以使得他們可執行一般功能。可使用本領域中已知的重組DNA技術來實現與重組載體的可操作地連接；并且可使用本領域通常已知的酶進行位點特異性DNA切割和連接。在本專利技術中，可包括用于提高基因表達的元件的SAR或MAR元件。可包括SAR或MAR元件來構成表達載體以使得這樣的元件可存在于啟動子的5’端、3’端或者5’和3’端二者。如本文所使用的“MAR元件”是指暫時將轉錄活性DNA環狀結構域附著至核基質(Nuclear matrix)的DNA序列(Pienta等，(1991)Crit.Rev.Eukaryotic Genne Expres.，1：355-385)，MAR序列的實例在本領域中是已知的。在本專利技術中，為了選擇提高基因表達的元件，針對人β-珠蛋白MAR(Yu，J.，Bock，J.H.，Slightom，J.L.和Villeponteau，B.，Gene 139(2)，139-145(1994)，基因庫No.L22754)和人CSP-B基因側翼(flanking)SAR(Hanson，R.D.和Ley，T.J.，Blood，79(3)，610-618(1992)，基因庫No.M62716)使用螢光素酶測定(luciferase assay)進行了雙重(5’和5’+3’)和順式+反式相關測試(cis+trans related test)；結果是篩選出某些合乎期望的元件(參見實施例1-1)。上述MAR或SAR元件本文檔來自技高網...

【技術保護點】
表達載體，其包含可操作地連接的猿猴病毒40(simian?virus?40，SV40)啟動子、支架附著區(scaffold?attachment?region，SAR)或基質附著區(matrix?attachment?region，MAR)元件以及嵌合內含子(chimeric?intron)。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.12.27 KR 10-2013-01653401.表達載體，其包含可操作地連接的猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)啟動子、支架附著區(scaffold attachment region，SAR)或基質附著區(matrix attachmentregion，MAR)元件以及嵌合內含子(chimeric intron)。2.根據權利要求1所述的表達載體，其中所述SV40啟動子由SEQ ID NO：12表示。3.根據權利要求1所述的表達載體，其中所述SAR元件由SEQ ID NO：39表示，并且所述MAR元件由SEQ ID NO：40或41表示。4.根據權利要求1所述的表達載體，其中所述嵌合內含子由SEQ ID NO：25表示。5.根據權利要求1所述的表達載體，其還包含由SEQ ID NO：15或16表示的基因座控制區(1ocus control region，LCR)元件。6.根據權利要求1所述的表達載體，其中表達受所述啟動子調控的靶基因被插入到所述表達載體中。7.權利要求6所述的表達載體，其中所述靶基因選自：因子VII(factor VII，FVII)基因、...

【專利技術屬性】
技術研發人員：金正燮，尹成泰，郭曦天，吳美淑，李秀珉，
申請(專利權)人：財團法人牧巖生命工學研究所，
類型：發明
國別省市：韓國;KR