一種新型高活力蒜氨酸酶及其制備方法技術

本發明專利技術涉及一種新型高活力蒜氨酸酶及其制備方法，其技術方案是利用隨機突變技術改造來源于大蒜鱗莖的野生型蒜氨酸酶基因，得到高活力的蒜氨酸酶突變體基因，即新型高活力蒜氨酸酶基因，然后將新型高活力蒜氨酸酶基因分別在枯草芽孢桿菌表達系統、畢赤酵母表達系統(包括畢赤酵母游離表達系統和畢赤酵母細胞表面展示系統)中表達，得到產高活力蒜氨酸酶的重組菌株，發酵表達后，檢測高活力蒜氨酸酶的比酶活較野生型蒜氨酸酶提高50％。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物工程領域，涉及通過易錯PCR技術體外定向進化構建的比酶活提高的新型蒜氨酸酶突變體，具體地說涉及到基因的隨機突變和重組DNA技術，尤其是一種新型高活力蒜氨酸酶及其制備方法。技術背景蒜氨酸酶又稱烷基半胱氨酸亞砜酶、C-S酶等(E.C.4.4.1.4)，1949年由Stoll和Seeback首先發現。它有二聚體、三聚體、四聚體等形式。不同的植物蛋白聚合形式是不同的，如大蒜(Alliium sativum)的蒜氨酸酶為二聚體，而洋蔥(Alliium cepa)的則為四聚體。國外學者已經從洋蔥、韭菜、熊蔥及大蒜中得到編碼蒜氨酸酶的基因，但所報道的基因序列、蛋白分子質量及生化性質有諸多分歧。Rabinkov等克隆的大蒜鱗莖蒜氨酸酶基因長達2200bp，為翻譯后剪切前未成熟酶(precursoralliinase)的全長基因序列。該蒜氨酸酶只存在于大蒜鱗莖及葉中，而不存在于大蒜根中，但其根中具有很高的酶活性，由此推斷大蒜根部含有蒜氨酸酶的同工酶。2000年，Lancaster等從洋蔥根中純化了一種新型蒜氨酸酶，得到了編碼洋蔥根蒜氨酸酶蛋白的cDNA，闡述了其結構與功能。1998年，Weik等研究了蒜氨酸酶在大腸桿菌、釀酒酵母及畢赤酵母中重組表達，獲得了重組蒜氨酸酶。2010年，來慶勤等克隆得到蒜氨酸酶基因，并在大腸桿菌中進行了表達，獲得了重組蛋白包涵體，經蛋白復性，重組蒜氨酸酶比活力高于Weik的報道。但與經植物化學方法直接從大蒜中提取的樣品相比尚不理想。2010年，吳曉莉等根據GenBank登錄的蒜氨酸酶序列設計引物，通過RT-PCR技術在國內首次克隆登錄了我國浙江大蒜鱗莖蒜氨酸酶基因。浙江蒜氨酸酶比GenBank登錄的大蒜蒜氨酸酶序列多了3個堿基，有9個位點發生突變。并將目的基因成功構建到pPICZαC畢赤酵母表達載體上。重組蒜氨酸酶具有酶活性，酶比活力為(82.09±3.89)U/mg，低于提取的天然蒜氨酸酶。大蒜在醫藥和保健方面的作用已得到普遍的認可，因而蒜氨酸酶的作用就顯得尤為重要。目前國內外生產的大蒜片劑和膠囊達到30種以上，從大蒜中分別提取蒜氨酸和蒜氨酸酶，利用蒜氨酸和蒜氨酸酶生產復合膠囊或注射針劑。因此，開展DNA分子重組技術構建蒜氨酸酶表達系統生產蒜氨酸酶，以及利用隨機突變提高酶活性和穩定性這些方面的研究，就成為提高蒜類藥品藥效的行之有效的途
徑，并將為蒜類藥品和保健品的開發與應用提供更廣闊的空間。酶分子體外定向進化屬于蛋白質的非理性設計，是蛋白質工程的新策略。利用分子生物學手段在分子水平創造出分子的多樣性，結合靈敏的篩選技術，迅速得到理想的突變體。它不需事先了解蛋白質的空間結構、活性位點、催化機制等因素，而是人為地創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外改造酶基因，獲得具有某些預期特征的結構酶。其中，易錯PCR是指在擴增目的基因的同時，利用Taq酶不具備3’→5’校對功能，同時改變反應體系中Mn2+、Mg2+和各種dNTP的濃度，以一定的頻率向目的基因隨機引入堿基錯配，導致目的基因發生隨機突變。然而，經一次突變的基因一般很難獲得滿意的結果，由此又發展出連續易錯PCR(Sequential Error-prone PCR)策略。即將一次PCR擴增得到的產物作為下一次PCR擴增的模板，連續反復地進行易錯，使每一次獲得的小突變不斷進行積累而產生重要的有益突變。因此，具有獨有的優勢。枯草芽孢桿屬于革蘭氏陽性菌。枯草芽孢桿菌表達系統有以下優點：1、能夠高效地分泌各種蛋白質；2、許多枯草芽孢桿菌在發酵工業上的使用已有相當長的歷史，無致病性，不產生任何內毒素；3、芽孢桿菌屬微生物遺傳學背景研究的十分清楚，并具有生長迅速，對營養無特殊要求的優點；4密碼子偏愛性不明顯；5發酵簡單，枯草芽孢桿菌是好氧菌，無需厭氧發酵設備，對培養基無特殊要求，發酵結束后，簡單地分離發酵液和細菌菌體，即可進入目的蛋白的純化回收階段；6具有抗逆性，可生產多種耐熱性酶制劑。畢赤酵母是一種單細胞低等真核生物，培養條件普通，生長繁殖速度迅速。畢赤酵母表達系統用于表達基因工程產品時，可以大規模生產，有效降低了生產成本。畢赤酵母表達系統具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質較原核表達系統表達的蛋白質更加穩定，畢赤酵母表達系統具有兩種表達形式，包括畢赤酵母游離表達系統和畢赤酵母細胞表面展示系統。畢赤酵母游離表達系統表達的外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質較原核表達系統表達的蛋白質更加穩定，某些酵母表達系統具有外分泌信號序列，能夠將所表達的外源蛋白質分泌到細胞外，易于純化，而畢赤酵母細胞表面展示系統除具有外源基因的翻譯后加工能力和蛋白的折疊加工及適度糖基化的優點外，經該系統得到的全細胞催化劑還可以重復利用從而降低生產成本。畢赤酵母表達系統已成為現代分子生物學研究最重要的工具和模型，是表達外源基因比較理想的工具。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種新型高活力蒜氨酸酶
突變體基因，本專利技術使用易錯PCR技術，對野生型蒜氨酸酶進行隨機突變，得到新型高活力蒜氨酸酶(Glu225Val、Glu267Phe)，新型高活力蒜氨酸酶的比酶活比野生型蒜氨酸酶的比酶活提高了50％。本專利技術的目的是采用以下技術方案完成的：一種新型高活力蒜氨酸酶突變體基因，其基因序列為SEQ ID NO：5。一種新型高活力蒜氨酸酶突變體基因的構建方法，將大蒜鱗莖野生型蒜氨酸酶基因進行隨機突變，第674位堿基A→T，第799位堿基G→T，第800位堿基A→T，第801位堿基A→C，得到新型高活力蒜氨酸酶突變體基因；所述大蒜鱗莖野生型蒜氨酸酶基因序列為SEQ ID NO：3。一種新型高活力蒜氨酸酶突變體，通過如序列3所示的核苷酸序列編碼的野生型蒜氨酸酶氨基酸序列中,第225位的氨基酸Glu替換為Val和第267位的氨基酸Glu替換為Phe，得到如序列6所示的氨基酸序列。一種新型高活力蒜氨酸酶突變體的制備方法，包括如下步驟：⑴通過易錯PCR隨機突變大蒜鱗莖的野生型蒜氨酸酶基因，第674位堿基A→T，第799位堿基G→T，第800位堿基A→T，第801位堿基A→C，得到新型高活力蒜氨酸酶突變體編碼基因；⑵將所述的新型高活力蒜氨酸酶突變體編碼基因酶切、連接到表達或展示載體，得到攜帶高活力蒜氨酸酶突變體編碼基因重組載體；⑶將重組載體轉化至宿主細胞，得到重組菌株；⑷表達所述的重組菌株，純化獲得如SEQ ID NO：6所示的新型高活力蒜氨酸酶。一種含有上述基因的表達載體以及宿主細胞。而且，所述的表達載體為pBSA43、所述的宿主細胞為枯草芽孢桿菌WB600。而且，所述的表達載體為pPIC9K、所述的宿主細胞為畢赤酵母GS115。而且，所述的展示載體為pPIC9K-Flo、所述的宿主細胞為畢赤酵母GS115。本專利技術的獨特之處有如下幾點：1、本專利技術中新型高活力蒜氨酸酶基因在枯草芽孢桿菌表達系統和畢赤酵母表達系統中進行了表達，分別得到枯草芽孢桿菌新型高活力蒜氨酸酶重組菌株和畢赤酵母新型高活力蒜氨酸酶重組菌株(包括畢赤酵母新型高活力本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種新型高活力蒜氨酸酶突變體基因，其特征在于：其基因序列為SEQ?ID?NO：5。

【技術特征摘要】
1.一種新型高活力蒜氨酸酶突變體基因，其特征在于：其基因序列為SEQ IDNO：5。2.一種如權利要求1所述的新型高活力蒜氨酸酶突變體基因的構建方法，其特征在于：將大蒜鱗莖野生型蒜氨酸酶基因進行隨機突變，第674位堿基A→T，第799位堿基G→T，第800位堿基A→T，第801位堿基A→C，得到新型高活力蒜氨酸酶突變體基因；所述大蒜鱗莖野生型蒜氨酸酶基因序列為SEQ ID NO：3。3.一種新型高活力蒜氨酸酶突變體，其特征在于：通過如序列3所示的核苷酸序列編碼的野生型蒜氨酸酶氨基酸序列中,第225位的氨基酸Glu替換為Val和第267位的氨基酸Glu替換為Phe，得到如序列6所示的氨基酸序列。4.一種如權利要求3所述的新型高活力蒜氨酸酶突變體的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：⑴通過易錯PCR隨機突變大蒜鱗莖的野生型蒜氨酸酶基因，第674位堿基A→T，第799位堿基G→T，第800位堿基A→T，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：路福平，劉逸寒，郭偉，韓楊，賈雷博，
申請(專利權)人：天津科技大學，
類型：發明
國別省市：天津;12