一株亞硝酸鹽降解菌制造技術

本發明專利技術公開了一株亞硝酸鹽降解菌，該亞硝酸鹽降解菌保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏名稱Daldinia?sp.?HYTC?TB2（以下簡稱HYTC?TB2），保藏編號：CCTCC?M?2016067，保藏日期2016年2月22日。本發明專利技術的亞硝酸鹽降解菌是從土壤中篩選出的，具有較高亞硝酸鹽耐受性及較高降解活性，高效安全，發揮其在環境修復方面的優勢，解決水體修復等問題。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及一種亞硝酸鹽降解菌Daldinia sp. HYTC-TB2及其在生產亞硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽降解中的應用。
技術介紹
亞硝酸鹽，是氮循環中無機結合氮的一種分子形態，其氮處于中間價態，酸性條件下具有較強的氧化性，在血液中可將血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，從而對高等動物體內氧的運輸有抑制作用。在體外，用亞硝酸鈉處理人紅細胞后，會引發紅細胞中酶和非酶介導的氧化應激，導致血紅蛋白失活聚集，脂質和蛋白質被氧化，且紅細胞內的主要代謝途徑亦發生改變。自然界可利用生物類群對被污染的環境，如亞硝酸鹽污染，進行自凈化作用。生物體可利用體內的亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase，NiR）把亞硝酸鹽還原為一氧化氮或氨。NiR廣泛存在于植物和微生物中，國內外的研究者們已經從植物、紅藻、細菌中分離并提純到亞硝酸鹽還原酶。早在1960s，Alcaligenes sp.，Neurospora crassa，Pseudomonas sp.等亞硝酸鹽降解菌就從污水中被分離出來了。但關于能降解亞硝酸鹽的真菌的研究起步較晚，1995年，Kobayashi, M等首次從真菌Fusarium oxysporum中分離出NiR，后有多種真菌的Cu-NiRs被報道。目前關于亞硝酸鹽還原酶及亞硝酸鹽降解菌的應用主要在生物傳感器、水體修復、食品保鮮等方面。其中水體養殖中亞硝酸鹽還原酶及亞硝酸鹽降解菌的應用比較廣泛，但已報道的該類酶或菌株的適用條件為弱酸性、溫度大于30℃，限制了其應用。
技術實現思路
本專利技術的目的是：提供一株亞硝酸鹽降解菌，從土壤中篩選出具有較高亞硝酸鹽耐受性及較高降解活性的真菌新種，高效安全，發揮在環境修復方面的獨特優勢，解決水體修復等問題。本專利技術的技術解決方案是：該亞硝酸鹽降解菌保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏名稱Daldinia sp. HYTC-TB2，保藏編號：CCTCC M 2016067，保藏日期2016年2月22日。本專利技術的亞硝酸鹽降解菌種：Daldinia sp.HYTC-TB2是從土壤中篩選出的菌；菌種描述：在PDA培養基上菌落生長較慢，28℃黑暗條件下5 d菌落直徑50~55 mm，菌落邊緣整齊，孢子很少，有香甜味；該菌株在以亞硝酸鈉為唯一氮源的培養基中生長，對亞硝酸鈉的耐受性及利用率較高，表明其具有較高的亞硝酸鹽降解活性。按照常規方法從Daldinia sp.HYTC-TB2的純培養物提取基因組DNA，運用rDNA內轉錄間隔區（ITS）序列特定引物ITS1/ITS4，通過PCR和測序得到ITS序列；在GenBank數據庫中進行同源性比對，發現HYTC-TB2與已知的Daldinia eschscholzii 的ITS序列的相似性為97%；結合其形態學特征，確定它是一株真菌新種，將其歸入炭棒科（Xylariaceae），命名為Daldinia sp. HYTC-TB2，該菌保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏名稱Daldinia sp. HYTC-TB2，保藏編號：CCTCC M 2016067，保藏日期2016年2月22日。將本專利技術的菌株Daldinia sp.HYTC-TB2接種于以亞硝酸鈉為唯一氮源的液體培養基中，研究其對培養基中亞硝酸鈉的利用率，結果表明：Daldinia sp.HYTC-TB2在以亞硝酸鈉為氮源的液體培養基（pH 7.4）中，在28℃，120 rpm/min條件下進行液體發酵，其中亞硝酸鈉濃度為1 g/L，每天取樣測試亞硝酸鈉含量變化；生長經過48 h的延滯期進入對數生長期，60 h后，處于穩定生長期，菌株在0～48 h處于亞硝態氮降解的延滯期；48 h后亞硝態氮濃度迅速下降，60 h降解率達99.8％，表明該菌具有較好的亞硝酸鹽降解活性。本專利技術的優點是：真菌新種Daldinia sp. HYTC-TB2具有產亞硝酸鹽還原酶活性，用于生產亞硝酸還原酶，對亞硝酸鈉的耐受性及利用率較高，表明其具有較高的亞硝酸鹽降解活性。附圖說明圖1為菌種純培養照片。圖2為菌種在不同濃度亞硝酸鈉平板培養基上生長照片。具體實施方式下面給出具體實施例對本專利技術的技術方案進一步說明，這些實施例不能理解為是對技術方案的限制。實施例1：菌株的分離篩選從河邊采污泥土樣，用無菌水進行梯度稀釋10-1、10-2、10-3，分別取各梯度稀釋液0.2 ml涂布于以亞硝酸鈉為氮源的查氏培養基（葡萄糖30 g/L、NaNO2 2.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0. 5 g/L、FeSO4·7H2O 0. 01 g/L、K2HPO4 1 g/L）平板上，28℃恒溫培養箱中倒置培養；待菌落長出后，從菌落中間挑取少量菌絲，再次轉接到以亞硝酸鈉為氮源的查氏培養基平板上，直至獲得純培養物，命名為Daldinia sp.HYTC-TB2，保存于PDA斜面上。實施例2：真菌Daldinia sp.HYTC-TB2的鑒定1、形態學鑒定：菌株的形態學初步鑒定依據《真菌鑒定手冊》；如圖1所示，在PDA培養基上菌落生長較慢，28℃黑暗條件下5天菌落直徑50~55 mm，菌落邊緣整齊，孢子很少，有香甜味；該菌株在以亞硝酸鈉為唯一氮源的培養基中生長，對亞硝酸鈉的耐受性及利用率較高，表明其具有較高的亞硝酸鹽降解活性。2、菌株分子生物學鑒定：菌株的DNA提取、PCR擴增及擴增產物的序列分析：將培養4 d的新鮮菌體作為DNA提取材料，采用尿素提取法提取菌株基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度；以上述提取的總DNA為模板，用引物ITS1/ITS4進行PCR；PCR產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序；測序結果如下：1 ttaactcagg acatctaact ccaccctatg tgaacttacc gccgttgcct cggcgggccg cgttcgccct gtagtttact81 acctggcggc gcgctacagg cccgccggtg gactgctaaa ctctgttata tatacgtatc tctgaatgct tcaacttaat161 aagttaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt241 gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgcccattag tattctagtg ggcatgcctg ttcgagcgtc321 atttcaaccc ttaagcccct gttgcttagc gttgggaatc taggtctcta gggcctagtt ccccaaagtc atcggcggag401 tcggagcgta ctctcagcgt agtaatacca ttctcgcttt tgcagtagcc ccggcggctt gccgtaaaac ccttatatct481 ttagtggttg acctcgaatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株亞硝酸鹽降解菌，其特征是：該亞硝酸鹽降解菌保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏名稱Daldinia?sp.?HYTC?TB2，保藏編號：CCTCC?M?2016067，保藏日期2016年2月22日。

【技術特征摘要】
1.一株亞硝酸鹽降解菌，其特征是：該亞硝酸鹽降解菌保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏名稱Daldinia sp. HYTC-TB2，保藏編號：CCTCC M 2016067，保藏日期2016年2月22日。2.根據權利要求1所述的一株亞硝酸鹽降解菌，其特征是：絲狀真菌Daldinia sp. H...

【專利技術屬性】
技術研發人員：汪偉，周玉珍，鄢貴龍，趙利琴，姜曉劍，唐玉玲，王新風，紀麗蓮，
申請(專利權)人：淮陰師范學院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32