本發明專利技術公開了一種岷江百合誘導型啟動子LrP1及其應用，LrP1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，本發明專利技術通過分子生物學和基因工程相關技術研究證實岷江百合啟動子LrP1響應幾種植物激素、生物和非生物脅迫；將本發明專利技術岷江百合啟動子LrP1與β?葡萄糖苷酸酶基因連接構建成的表達框轉入煙草中表達，通過熒光法定量檢測轉基因煙草的葡萄糖苷酸酶活性，結果表明轉基因煙草在赤霉素、乙烯、脫落酸、NaCl、受傷、尖孢鐮刀菌、核盤菌、灰葡萄孢處理后葡萄糖苷酸酶活性明顯增強；可見岷江百合啟動子LrP1受幾種激素、生物和非生物脅迫因子的誘導，能用于植物抗逆境基因工程。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學以及基因工程相關研究領域，具體涉及一種誘導型啟動子LrP1及其應用。
技術介紹
啟動子是位于結構基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確的結合并具有轉錄起始的特異性。植物中常見的啟動子有組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子。組成型啟動子(constitutive promoter)是指在該類啟動子控制下，結構基因的表達大體恒定在一定水平上，在不同組織、部位表達水平沒有明顯差異。組織特異啟動子(tissue-specific promoter)又稱器官特異性啟動子，分為根特異啟動子、莖特異啟動子等。在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現出發育調節的特性。利用基因工程的方法將水稻(Oryza sativa)蔗糖合酶基因啟動子RSP1和RSP2轉入水稻，結果表明RSP1和RSP2都可以驅動β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因在根、莖、葉及穎殼中高效特異表達，但在胚和胚乳中不表達（李永春，張憲銀，薛慶中. 蔗糖合酶基因啟動子克隆及其轉基因水稻植物中特異性表達. 作物學報, 2002, 28(5):586-590）。誘導型啟動子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。誘導型啟動子可以在植物受到外界物理或化學脅迫時提高基因的表達量，在去除脅迫后停止對基因的調控。誘導型啟動子的這個特性可保證在植物受到外界脅迫時起到保護植物、抵抗外界刺激的效果，并且在適宜的環境中保證植物能量不浪費。在基因工程中，轉入植物的外源基因如不加以控制，會在植物體內大量表達，導致蛋白大量積累且浪費能量。在載體上加入誘導型啟動子可以在外界刺激時調控目的基因的表達，很好的解決了外源基因無限制表達的問題。誘導型啟動子包括非生物誘導型啟動子和生物因素誘導型啟動子。非生物因素誘導型啟動子包括干旱、鹽刺激、溫度等誘導型啟動子；生物因素誘導型啟動子即指病蟲害誘導的啟動子。利用基因組末端隨機擴增技術，從斑茅(Erianthus arundinaceus)的PR10基因末端擴增出592bp的啟動子，并連接與GUS報告基因轉入煙草、水稻和甘蔗中，結果表明斑茅PR10啟動子可以很快響應傷害、茉莉酸甲酯和脫落酸的處理（Chakravarthi M, Syamaladevi DP, Harunipriya P, Augustine SM, Subramonian N. A novel PR10 promoter from Erianthus arundinaceus directs high constitutive transgene expression and is enhanced upon wounding in heterologous plant systems. Mol Biol Rep, 2016, 43(1):17-30）。從西部白松（Pinus monticola）中克隆得到PmPR10-1.13的啟動子和三個5’缺失端，連接報告基因GUS后轉入擬南芥。結果顯示GUS最早出現在2-3天幼苗的胚軸和子葉，后在植株的頂端大量表達。但在成年植株中，PmPR10-1.13啟動子響應病原體侵染和傷口脅迫，表明PmPR10-1.13啟動子響應生物或非生物脅迫（Liu JJ，Ekramoddoullah AK，Piggott N, Zamani A. Molecular cloning of a pathogen/wound-inducible PR10 promoter from Pinus monticola and characterization in transgenic Arabidopsis plants. Planta, 2005, 221(2):159-169）。蘆筍(Asparagus officinalis)中克隆得到一個PR10基因(AoPR10)的啟動子，將AoPR10啟動子連接報告基因GUS轉入擬南芥中并給與適當的逆境處理，GUS基因會在受傷、病原體侵染以及H2O2處理部位表達并積累，表明AoPR10啟動子受上述生物和非生物脅迫因子的誘導（Mur LA，Sturgess FJ，Farrell GG，Draper J. The AoPR10 promoter and certain endogenous PR10 genes respond to oxidative signals in Arabidopsis. Mol Plant Pathol, 2004, 5(5):435-451）。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種誘導型啟動子LrP1，來源于岷江百合，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本專利技術另一目的是將該啟動子應用在基因工程中，即在逆境脅迫下作為誘導表達啟動子調控外源基因在轉基因受體植物中的特異高效表達。本專利技術涉及分離誘導型啟動子片段并鑒定其表達活性，本專利技術從岷江百合中克隆獲得誘導型啟動子，該啟動子全長為1489bp；生物信息學分析表明誘導型啟動子中包含一系列不同的順式作用元件，如組織特異性元件，多種激素(脫落酸、赤霉素、乙烯、水楊酸、茉莉酸甲酯)的響應元件，非生物脅迫(水分、高鹽、傷害)響應元件，防衛基因響應病原菌誘導轉錄的元件等。WRKY轉錄因子在植物抗病防衛反應中起重要的調控作用，該誘導型啟動子序列具有三個WRKY的順式作用元件w box（C/TTGACC/T）。將本專利技術分離克隆的誘導型啟動子片段置換pBI121載體上的CaMV的35s啟動子，由誘導型啟動子驅動報告基因GUS的表達框，通過根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導將轉入模式植物煙草(Nicotiana tabacum)中表達，并通過進一步實驗揭示誘導型啟動子的表達特性，為后期利用該啟動子調控外源基因在轉基因植株中的高效特異表達奠定基礎。專利技術人將這個啟動子命名為LrP1。將本專利技術中LrP1啟動子驅動GUS的表達框轉入煙草中，采用幾種植物激素、生物和非生物脅迫處理轉基因煙草植株，并進行GUS活性的熒光定量分析，檢測結果表明，LrP1啟動子響應幾種非生物、生物脅迫及幾種植物激素的處理，赤霉素、乙烯、脫落酸、NaCl、傷害、尖孢鐮刀菌、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)能明顯誘導啟動子LrP1的活性。上述啟動子LrP1可以在基因工程應用于外源基因的誘導表達，具體操作如下：(1)采用擴增LrP1的特異引物，從岷江百合幼嫩組織中提取基因組DNA，通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增出LrP1的全長序列，然后將其連接到pGEM-T載體上，經測序獲得具有序列正確的克?。?2)用限制性內切酶酶切pGEM-T-LrP1載體，回收啟動子片段；同時采用合適的限制性內切酶酶切去除植物表達載體上的組成型表達啟動子，通過膠回收得到載體大片段；再將所獲得LrP1片段與pCAMBIA2300S載體片段連接，構建植物誘導表達本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種誘導型啟動子LrP1，來源于岷江百合，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技術特征摘要】
1.一種誘導型啟動子LrP1，來源于岷江百合，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.權利要求1所述的誘導型啟動子LrP1在...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉迪秋，關瑞攀，曲媛，楊野，葛鋒，何華，
申請(專利權)人：昆明理工大學，
類型：發明
國別省市：云南;53
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