本發明專利技術涉及一種A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原及其應用。本發明專利技術獲得的人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，命名為P41。該蛋白具有很強的免疫原性，利用所述抗原蛋白制備的亞單位疫苗，能夠明顯增強雞對A型副雞禽桿菌的抵抗力，其保護效果優于全菌滅活疫苗，可有效預防副雞禽桿菌的感染。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于家禽傳染病疫苗制備
，尤其涉及一種A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原及其應用。
技術介紹
副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)為巴氏桿菌科的一種短小革蘭氏陰性桿菌，基本特征為無運動性、菌體呈多形性、強毒株帶有莢膜。1932年De Blieck首先報道了自鼻道和鼻竇黏膜具有急性卡他性炎癥、面部水腫和結膜炎的雞群中首次分離出一種革蘭氏陰性桿菌。最初的研究報道指出該病原菌生長條件中既需要X(血紅素晶)因子，也需要V(煙酰胺腺嘌啉二核苷酸，NAD)因子，早期的研究者將其命名為雞嗜血桿菌(Haemophilus gallinarum)。1962年，Page等人研究發現所有IC病例的分離株生長只需要V因子。因此，有學者提議將只需要V因子的雞嗜血桿菌命名為—個新種：副雞嗜血桿菌(H.paragallinarum)，并被廣泛接受。近年來，在南非、墨西哥等地已從患鼻炎的雞中分離到不依賴V因子的副雞嗜血桿菌菌株。因此，嚴格按照在體外生長因子需要進行嗜血菌的分類并不科學。2005年，Blackall等將副雞嗜血桿菌的名稱改為副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum)。副雞禽桿菌作為雞的一種重要的呼吸道病原菌，常引起雞的傳染性鼻炎(infectious coryza,IC)，該病在世界范圍內廣泛傳播，給養雞業造成愈來愈嚴重的經濟損失。目前國內已有許多養雞場發生該病的報道。從感染部位來看，副雞禽桿菌感染的是呼吸系統中最前沿的部位--鼻道和鼻竇黏膜，可以說是呼吸道疾病的門戶病。這第一屏障被破壞，其他病原的感染率就大大增加。若與其它病原如雞傳染性支氣管炎病毒、雞支原體、雞傳染性喉氣管炎等并發感染后引起雞呼吸道疾病綜合征，會給養雞業造成更大的損失。各種日齡的雞都易感該菌，常見于13周齡以上的雞，通常表現為低死亡率和高發病率，產蛋率下降10％～40％。該病病理變化主要表現在上呼吸道急性卡它性炎癥典型癥狀是黏液性鼻竇炎，鼻竇黏膜水腫充血、黏膜桿狀細胞滲出，并且伴隨有異噬性白細胞和巨噬細胞，產生典型的鼻炎病變。臨床表現為面部單側或雙側腫脹、流鼻涕，食欲下降、產蛋率下降。雞傳染性鼻炎是一種呼吸道傳染病，目前主要靠滅活疫苗來控制。滅活疫苗的免疫效果可能與所激發的黏膜抗體相關。研究表明A、B、C三個血清型的Apg均有不同程度的致病力，但三者的滅活菌體不存在型間交叉免疫，只存在型內交叉免疫保護。目前國際上普遍使
用的滅活疫苗絕大多數都包含了A型和C型，隨著國內外陸續發現有大量B型Apg的流行和發生，國際上影響較大的疫苗公司已經開始提供包含A、B、C三種血清型的三價滅活疫苗。另一方面，由于副雞禽桿菌含有LPS等毒素物質，大量接種所帶來毒副作用也會影響雞的產蛋與生長，因此導致了生產上免疫失敗時有發生。雞傳染性鼻炎滅活疫苗對野外雞群感染的預防效果大約為70-80％，在其效力檢驗中由于環境和評價方法的不盡一致可能會有不同的結果。因此，需要研究更為安全有效的副雞禽桿菌疫苗，既不影響雞的產蛋與生長，又能提高對雞傳染性鼻炎的防疫效果。
技術實現思路
為彌補現有的副雞禽桿菌疫苗免疫效果欠佳的不足，本專利技術提供一種人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白，該抗原蛋白免疫原性強，能夠覆蓋多種副雞禽桿菌變異株，利用該抗原蛋白可制備對A型副雞禽桿菌預防效果顯著的亞單位疫苗。本專利技術請求保護的技術方案如下：一種人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。一種A型副雞禽桿菌亞單位疫苗，其特征在于，其活性組分包括權利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白。所述A型副雞禽桿菌亞單位疫苗，其特征在于，所述人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的終濃度為10μg/ml。用于編碼所述人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的基因。所述基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。一種表達權利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的重組表達載體，其特征在于，其表達外源蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述重組表達載體是大腸桿菌重組表達載體pET28a-P41，是利用NcoI和XhoI酶切獲得SEQ ID NO：2所示的核苷酸片段，并連接到pET28a的NcoI與XhoI酶切位點之間所得。一種表達權利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的重組大腸桿菌菌株，其特征在于，其包含權利要求7所述的重組表達載體pET28a-P41。權利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：獲得權利要求6或7所述的重組表達載體，導入到表達系統中誘導表達獲得所述人工A
型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白。本專利技術利用在線抗原表位預測軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/，對A型副雞禽桿菌Hmtp210的基因(GenBank:KJ867495.1，全長6129bp)及其全蛋白序列(2042個氨基酸殘基)進行抗原表位分析，篩選免疫原性較強的抗原表位，并根據經驗截取其中部分抗原表位，以便所得的抗原蛋白的大小適合于大量制備并具有良好的免疫活性，最后將優化的各抗原表位進行拼接，獲得了SEQ ID NO：1所示的一段融合肽，作為人工A型副雞禽桿菌抗原蛋白，命名為P41。對該抗原蛋白P41的抗原特性進行實驗分析，Western Blotting實驗證明了該抗原蛋白具有較好的免疫原性，使用該抗原蛋白免疫試驗雞后能保護試驗雞只不受同型副雞禽桿菌感染。實驗數據還表明，該抗原蛋白P41能夠針對多株流行的副雞禽桿菌，如Hp8、221、0083等A型菌株，且保護效果優于全菌常規滅活疫苗。利用本專利技術的抗原蛋白P41制備亞單位疫苗，能夠明顯增強雞對副雞禽桿菌的抵抗力，有效預防副雞禽桿菌的感染。在本專利技術的一個實施例中，攻毒保護率實驗表明，采用P41抗原蛋白免疫的雞群在A型副雞禽桿菌攻毒后，所有雞只沒有出現鼻炎癥狀，保護率為100％；采用全菌常規滅活疫苗免疫的雞群在攻毒后3天內有2-3只雞出現臨床癥狀，保護率為70～80％；而未進行免疫的對照組雞群在攻毒后全部出現鼻炎癥狀，發病率為100％。免疫組與非免疫組的保護率有極顯著差異。因此，本專利技術的抗原蛋白是一種很好的免疫保護性抗原，其保護效果優于全菌滅活疫苗，可以作為副雞禽桿菌亞單位疫苗的候選抗原。本專利技術還提供一種副雞禽桿菌亞單位疫苗，其活性組分包括上述副雞禽桿菌抗原蛋白P41。在本專利技術的一些實施例中，將所述抗原蛋白P41與弗氏完全佐劑或不完全佐劑進行等體積混合乳化，制備副雞禽桿菌亞單位疫苗。在本專利技術的另一些實施例中，所述抗原蛋白P41還可以與本領域已知的能夠作為禽類疫苗的其它蛋白或滅活菌聯用，制備聯合疫苗。所述亞單位疫苗中副雞禽桿菌抗原蛋白的終濃度優選為10μg/ml。本專利技術還提供所述人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的制備方法。其表達系統可以采用原核表達系統或真核表達系統，原核表達系統優選大腸埃希氏菌BL21(DE3)，真核表達系統可以是酵母菌或原生質體。相應地，選用與之匹配的表達載體、轉化條件、表達條件及蛋本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技術特征摘要】
1.一種人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一種A型副雞禽桿菌亞單位疫苗，其特征在于，其活性組分包括權利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白。3.根據權利要求2所述的A型副雞禽桿菌亞單位疫苗，其特征在于，所述人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的終濃度為10μg/ml。4.用于編碼權利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的基因。5.根據權利要求4所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。6.一種表達權利要求1所述的人工A型副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的重組表達載體，其特征在于，其表達外源蛋白的基因的核...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王宏俊，李淑芳，龔玉梅，張培君，李桂萍，
申請(專利權)人：北京市農林科學院，
類型：發明
國別省市：北京;11
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