本發明專利技術公開了一種血液中DC細胞及CIK種子細胞的凍存方法及制備的細胞與用途，將外周血或者臍帶血中的單個核細胞通過適當的處理后，凍存在自體血清中，配合細胞凍存保護劑使細胞的存活率達到80％。復蘇后的細胞能夠滿足同時制備DC?細胞和CIK細胞，并最終制備成能夠滿足臨床應用需求的DC?CIK細胞制劑。這樣就能夠實現單次采血進行多次DC?CIK臨床治療的需求，從而為免疫細胞治療的規模化發展提了支持。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物領域，尤其是一種血液中DC細胞及CIK種子細胞的凍存方法及制備的細胞與用途。
技術介紹
免疫細胞治療作為目前公認的對抗腫瘤的第四種醫療手段，因其安全，有效、無副作用等優勢而逐漸被主流醫學界所接受。目前的免疫細胞制備方法主要是采集患者的外周血，分離外周血單個核細胞并進行體外培養擴增。這種方法存在的最大問題是每次治療均需要采集外周血，這就為患者帶來重復的損傷，并且在某些情況下患者是不適宜采集外周血的。所以，這就需要一種能夠單次采集后長期保存細胞，并能夠滿足多次使用的細胞存儲的方法。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是，提供一種利用自體血清的血液中DC細胞及CIK種子細胞的凍存方法及制備的細胞與用途。為了解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案是：一種血液中DC細胞及CIK種子細胞的凍存方法，將外周血或者臍帶血中的單個核細胞通過處理后，配合細胞凍存保護液凍存在自體血清中。包括以下步驟：1)自體血清的制備：a.采集80-120ml外周血或者臍帶血，按照體積比1:1的比例加入生理鹽水，混合均勻后通過Ficoll淋巴細胞分離液處理分離出血漿和單個核細胞；b.將血漿在55-58℃條件下滅活30min，滅活后的血漿在4500g-6000g的條件下離心8-12min，以0.22um濾膜過濾上清并最終制備出自體血清；2)單個核細胞的凍存：a.分離出的單個核細胞以含體積分數1％FBS的生理鹽水清洗一次后，以免疫細胞培養基重懸細胞并計數；b.配制DC細胞誘導培養基：免疫細胞培養基中含體積分數5-8％的FBS，終濃度50-100IU/ml的IL-4、終濃度500-1500IU/ml的GM-CSF；c.按照細胞計數結果取(1-2)×107個細胞接種于T-175細胞培養瓶中，并加入40mlDC細胞誘導培養基，混合均勻后孵育；d.誘導培養0.5-2h后輕輕吸取培養上清及未貼壁的細胞至50ml離心管中，300-320g條件下離心8-10min，將離心上清重新加入到DC細胞培養瓶中，誘導培養；e.細胞凍存液的配制：將制備的自體血清與DEX-40細胞凍存液按照體積比4:1的比例混合均勻后放置在4℃冰箱中備用；f.離心的沉淀細胞加入到未使用的單個核細胞中，混合均勻后計數，然后300-320g條件下離心8-10min，離心后棄掉上清，按照細胞計數的結果以細胞凍存液重懸細胞，使細胞的終濃度達到1×107/ml，按照3-4ml/管加入到細胞凍存管中，將細胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80℃中，12-72h后將細胞轉移到液氮中長期保存；g.DC細胞誘導培養的第3-5天，將培養上清以及懸浮細胞轉移到50ml離心管中，以PBS清洗細胞并將清洗液轉移到另一個50ml離心管中，以Tryple消化液消化細胞3-7min，以PBS沖洗并將消化的細胞轉移到離心管中，將兩個離心管300-320g條件下離心8-10min，棄上清并以細胞凍存液重懸細胞，調整細胞濃度至2×106/ml，按照2-3ml/管加入到細胞凍存管中，將細胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80℃中，12-72h后將細胞轉移到液氮中長期保存。所述的血液中DC細胞及CIK種子細胞的凍存方法得到的DC細胞和CIK種子細胞。所述的血液中DC細胞及CIK種子細胞的凍存方法得到的DC細胞和CIK種子細胞復蘇后制備DC-CIK制劑的用途。本專利技術的有益效果是：本專利技術從外周血或者臍帶血中分離出自體血清以及單個核細胞，通過將單個核細胞進行分別處理后重懸于自體血清及細胞凍存保護液配制的凍存試劑中，并將細胞在-196℃液氮中進行長期保存的方法。以這種方法凍存的細胞，復蘇后的細胞回收率能夠達到80％。并且能夠滿足多次制備達到臨床治療標準的DC-CIK制劑的需求。并且，在單個核細
胞的存儲過程中自體血漿是副產物，一般會廢棄，本專利技術通過簡單的方法制備自體血清并用于單個核細胞的凍存，既避免了FBS的使用，又能夠更好的提高單個核細胞的回收效率。附圖說明圖1是誘導7天的DC細胞及CIK細胞(左圖是DC細胞，右圖是CIK細胞)。圖2是CIK細胞生長曲線。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本專利技術作進一步詳細說明：自體血清的制備：采集80-120ml外周血或者臍帶血，按照體積比1:1的比例加入生理鹽水，混合均勻后通過Ficoll淋巴細胞分離液處理分離出血漿和單個核細胞；將血漿在55-58℃條件下滅活30min，滅活后的血漿在4500g-6000g的條件下離心8-12min，以0.22um濾膜過濾上清并最終制備出自體血清；單個核細胞的凍存：1.分離出的單個核細胞以含1％FBS的生理鹽水清洗一次后，以免疫細胞培養基重懸細胞并計數；2.配制DC細胞誘導培養基：免疫細胞培養基中含體積分數5-8％的FBS，終濃度50-100IU/ml的IL-4、終濃度500-1500IU/ml的GM-CSF；3.按照細胞計數結果取1-2*107個細胞接種于T-175細胞培養瓶中，并加入40mlDC細胞誘導培養基，混合均勻后孵育；4.誘導培養0.5-2h后輕輕吸取培養上清及未貼壁的細胞至50ml離心管中，300-320g條件下離心8-10min，將離心上清重新加入到DC細胞培養瓶中，誘導培養；5.細胞凍存液的配制：將制備的自體血清與DEX-40細胞凍存液按照體積比4:1的比例混合均勻后放置在4℃冰箱中備用；6.離心的沉淀細胞加入到未使用的單個核細胞中，混合均勻后計數，然后300-320g條件下離心8-10min，離心后棄掉上清，按照細胞計數的結果以細胞凍存液重懸細胞，使細胞的終濃度達到1*107/ml，按照3-4ml/管加入到細胞凍存管中，將細胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入
-80℃中，12-72h后將細胞轉移到液氮中長期保存；7.DC細胞誘導培養的第3-5天，將培養上清以及懸浮細胞轉移到50ml離心管中，以PBS清洗細胞并將清洗液轉移到另一個50ml離心管中，以Tryple消化液消化細胞3-7min，以PBS沖洗并將消化的細胞轉移到離心管中，將兩個離心管300-320g條件下離心8-10min，棄上清并以細胞凍存液重懸細胞，調整細胞濃度至2*106/ml，按照2-3ml/管加入到細胞凍存管中，將細胞凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入-80℃中，12-72h后將細胞轉移到液氮中長期保存；DC-CIK細胞的復蘇、培養：1.CIK細胞誘導培養基的配制：免疫細胞培養基中含有體積分數4-8％的FBS，終濃度200-1000IU的IL-2；2.在一個T-175細胞培養瓶中加入5ml含有5-10ng CD3Mab的CIK細胞誘導培養基，4℃冰箱包被過夜；3.復蘇一支凍存的單個核細胞，將融化后的細胞懸液加入到15-20ml的免疫細胞培養基中，300-320g條件下離心8-10min，棄上清并加入CIK細胞誘導培養基至終體積45ml，重懸細胞后加入預先包被的T-175細胞培養瓶中，并按照300-1000IU/ml的終濃度加入IFN-r，混合均勻后開始誘導培養；4.按照每隔一天加入培養體系中等體積的CIK細胞誘導培養基的方法對CIK細胞進行擴增培養；5.本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種血液中DC細胞及CIK種子細胞的凍存方法，其特征在于，將外周血或者臍帶血中的單個核細胞通過處理后，配合細胞凍存保護液凍存在自體血清中。
【技術特征摘要】
1.一種血液中DC細胞及CIK種子細胞的凍存方法，其特征在于，將外周血或者臍帶血中的單個核細胞通過處理后，配合細胞凍存保護液凍存在自體血清中。2.根據權利要求1所述的血液中DC細胞及CIK種子細胞的凍存方法，其特征在于，包括以下步驟：1)自體血清的制備：a.采集80-120ml外周血或者臍帶血，按照體積比1:1的比例加入生理鹽水，混合均勻后通過Ficoll淋巴細胞分離液處理分離出血漿和單個核細胞；b.將血漿在55-58℃條件下滅活30min，滅活后的血漿在4500g-6000g的條件下離心8-12min，以0.22um濾膜過濾上清并最終制備出自體血清；2)單個核細胞的凍存：a.分離出的單個核細胞以含體積分數1％FBS的生理鹽水清洗一次后，以免疫細胞培養基重懸細胞并計數；b.配制DC細胞誘導培養基：免疫細胞培養基中含體積分數5-8％的FBS，終濃度50-100IU/ml的IL-4、終濃度500-1500IU/ml的GM-CSF；c.按照細胞計數結果取(1-2)×107個細胞接種于T-175細胞培養瓶中，并加入40mlDC細胞誘導培養基，混合均勻后孵育；d.誘導培養0.5-2h后輕輕吸取培養上清及未貼壁的細胞至50ml離心管中，300-320g條件下離心8-10min，將離心上清重新加入到DC細胞培養瓶中，誘導培養；e.細胞凍存液的配制：...
【專利技術屬性】
技術研發人員：韓洪起，魯振宇，劉俊江，張冰晶，秦臻，徐悅，
申請(專利權)人：天津普瑞賽爾生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。