尿液中修飾核苷的檢測方法技術

本發明專利技術提供了一種尿液中修飾核苷的檢測方法，具體包括如下步驟：尿液預處理后保存于濾紙片上，后通過萃取得到待測樣本；將所述待測樣本通過液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量。本發明專利技術提供的檢測方法中，通過將尿液保存于濾紙片上再通過萃取過程，運用液質聯用方法，能夠快速、有效地對尿液中的修飾核苷進行定性和定量檢測。由于將尿液保存于濾紙片上，將尿液樣品轉換為固體形式進行保存，穩定性大大提高，從而避免微生物污染檢測樣品。而且，本發明專利技術提供的方法也比現有的冷凍法更為簡易、方便。

【技術實現步驟摘要】
尿液中修飾核苷的檢測方法
本專利技術涉及液譜質譜聯用
，具體而言，涉及一種尿液中修飾核苷的檢測方法。
技術介紹
修飾核苷主要存在于RNA中，是在轉錄后由特定的甲基轉移酶與連接酶作用于多聚核苷分子而形式。RNA代謝都需要特定的酶來催化，正常核苷酶解后可降解或者磷脂化再利用，而修飾核苷是正常核苷的糖苷鍵、堿基、糖羥基被修飾或者兩兩結合生成的獨特性結構，由于被高度修飾，降解修飾核苷需要的酶活性較高，特異性強，因此，修飾核苷從細胞中釋放出來，最終通過尿液排出。故，尿液中修飾核苷的含量可用來評價人體的核苷代謝狀況。目前，已有報道采用毛細管電泳法對尿液中修飾核苷進行檢測，但該方法檢測出的修飾核苷類別少。而且，由于尿液中含有多種微生物。如果長時間以液體形式保存，微生物就會污染尿液，影響檢測結果的準確性，現有的檢測方法中都是將待檢測尿液取樣后存儲于冰箱中冷凍保存，檢測時再解凍，不但需要冷凍裝置，解凍步驟也使得檢測時間變長。有鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種尿液中修飾核苷的檢測方法。針對檢測樣品易受微生物污染的缺點，本專利技術提供的檢測方法中將尿液保存于濾紙片上，不但使其穩定性大大提高，避免微生物的污染，而且還具有簡易、方便的優點。為了實現本專利技術的上述目的，特采用以下技術方案：尿液中修飾核苷的檢測方法，包括如下步驟：(1)尿液預處理后保存于濾紙片上，后通過萃取得到待測樣本；(2)將所述待測樣本通過液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量。本專利技術提供的檢測方法中，通過將尿液保存于濾紙片上再通過萃取過程，運用液質聯用方法，能夠快速、有效地對尿液中的修飾核苷進行定性和定量檢測。由于將尿液保存于濾紙片上，將尿液樣品轉換為固體形式進行保存，穩定性大大提高，從而避免微生物污染檢測樣品。而且，本專利技術提供的方法也比現有的冷凍法更為簡易、方便。優選地，步驟(1)中，所述萃取的步驟具體包括：將濾紙片放入甲醇水混合溶液中經超聲、離心后取上清液作為待測樣本。本專利技術提供的檢測方法中，為了將保存在濾紙片上的尿液樣本充分還原，將濾紙片放入甲醇水混合溶液中進行超聲，使得濾紙片上的各個組分充分溶解到溶液中，后再經離心得到上清液，將這一上清液作為待測樣本。在實際檢測過程中，可將保存有尿液的濾紙片打孔，孔徑為3mm，獲得直徑為3mm的濾紙圓片，取適量的濾紙圓片置于離心管中，加入甲醇水溶液后進行超聲、離心操作。為了保證濾紙片中的各個組分能夠充分溶解至溶液中，所用的甲醇水溶液中甲醇的體積含量為5％-50％，超聲時間為20-90min。經超聲后，溶液中不但含有修飾核苷，還含有其它固體雜質，影響檢測結果的準確性，為了將雜質盡可能地去除，在本專利技術提供的檢測方法中，將離心的轉速控制在10000-18000rpm，時間為5-30min。為了保證檢測樣本的穩定性，步驟(1)中，所述尿液預處理后保存于濾紙片上的步驟具體包括：向尿液中加入8-溴鳥苷混合后滴于濾紙片上，并風干3小時以上。在上述方法中，加入的8-溴鳥苷作為內標物，用以對修飾核苷進行定量分析。優選地，步驟(2)具體包括：(21)稱取標準品，用甲醇溶解，得到不同濃度的標準液；(22)稱取內標物，用甲醇水溶液溶解后分別加入所述標準液中，超純水定容后離心，取上清液作為待測標準液；(23)將所述待測樣本和所述待測標準液通過液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量。本專利技術提供的檢測方法中，采用內標法對尿液中的修飾核苷的含量進行檢測。在檢測過程中，稱取標準品用甲醇使其完全溶解，得到不同濃度的標準液，向標準液中加入內標物后經處理得到待測標準液，用以進行液質聯用檢測，分別以各修飾核苷的峰面積與內標物峰面積之比對尿樣中各修飾核苷的濃度進行線性回歸，得到各修飾核苷的線性方程，用于對尿液中各修飾核苷進行定量分析。為了保證液質聯用檢測結果的準確性，本專利技術采用特定的液相條件和質譜條件，具體的，步驟(23)中，所述液質聯用檢測的液相條件為：流動相的流速為0.1-1.0mL/min；進樣量1-20μL；鍵合相色譜柱；柱溫20-40℃；A和B作為流動相，其中A為甲醇水溶液，B為甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序如表1所示。表1梯度洗脫程序質譜條件為：采用ESI離子源，正離子MRM掃描，霧化氣流速8-20L/min，氣簾氣流速8-20L/min，碰撞氣流速5-15L/min，離子源電壓2000-4000V，離子源溫度200-400℃。通過上述液相色譜和質譜檢測后，可有效地對尿液中的修飾核苷進行定性和定量分析。并且，分析速度快，完成一次分析只需13分鐘。由于修飾核苷種類多，為了保證能夠盡可能地將尿液中的修飾核苷分離，進一步優選地，所述液相條件中，流動相A為0.1-10％甲醇水溶液，B為0.1-10％甲酸甲醇溶液?；谕瑯拥目紤]，所述液相條件中，所述鍵合相色譜柱為C18/C8色譜柱，規格為(50-100)mm×(1.8-3)mm，(1.8-3)μm。優選地，步驟(21)中，所述標準品包括假尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、1-甲基腺苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、1-甲基次黃嘌呤核苷、5-甲基尿苷、黃嘌呤核苷、3-甲基尿苷、1-甲基鳥苷、6-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、N4-乙酰基胞苷和N2,N2-二甲基鳥苷。在本專利技術提供的檢測方法中，所用的標準品包含16種，可實現16種修飾核苷的定性和定量分析，使得檢測范圍提高。優選地，步驟(22)中，所述內標物為8-溴鳥苷。在本專利技術提供的檢測方法中，選用8-溴鳥苷作為內標物，穩定性好，能夠用于對尿液中的修飾核苷進行定量分析。與現有技術相比，本專利技術的有益效果為：(1)本專利技術將尿液保存在濾紙片上，使其穩定性大大提高，避免了微生物對檢測樣品的污染，解決了尿液無法長時間保存、運輸的問題。(2)本專利技術通過對萃取過程的優化，可使得濾紙片上的各個組分充分溶出，能夠還原檢測樣品的真實性，使得檢測結果的準確性大大提高。(3)本專利技術通過對液質聯用檢測過程中的液相條件和質譜條件的優化，實現對尿液中修飾核苷的定性和定量分析，靈敏度高，準確性高，分析速度快。(4)本專利技術提供的檢測方法中，采用8-溴鳥苷作為內標物，采用假尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、1-甲基腺苷、尿嘧啶核苷(U)、腺嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、1-甲基次黃嘌呤核苷、5-甲基尿苷、黃嘌呤核苷、3-甲基尿苷、1-甲基鳥苷、6-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、N4-乙酰基胞苷和N2,N2-二甲基鳥苷這16中修飾核苷作為標準品，可對尿液中的16種修飾核苷同時進行定性和定量分析，滿足實際檢測的需要。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術實施例或現有技術中的技術方案，以下將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1為本專利技術實施例的檢測譜圖。具體實施方式下面將結合實施例對本專利技術的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本專利技術，而不應視為限制本專利技術的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。實施例儀器和材料：美國Agilent公司6495串聯質譜儀，Angilent1290液相色譜儀，色譜柱為AgilentC18柱，規格為50mm×3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
尿液中修飾核苷的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)尿液預處理后保存于濾紙片上，后通過萃取得到待測樣本；(2)將所述待測樣本通過液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量。

【技術特征摘要】
1.尿液中修飾核苷的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)尿液預處理后保存于濾紙片上，后通過萃取得到待測樣本；(2)將所述待測樣本通過液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量；步驟(1)中，所述萃取的步驟具體包括：將濾紙片放入甲醇水混合溶液中經超聲、離心后取上清液作為待測樣本；步驟(2)具體包括：(21)稱取標準品，用甲醇溶解，得到不同濃度的標準液；(22)稱取內標物，用甲醇水溶液溶解后分別加入所述標準液中，超純水定容后離心，取上清液作為待測標準液；(23)將所述待測樣本和所述待測標準液通過液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量；步驟(23)中，所述液質聯用檢測的液相條件為：流速為0.1-1.0mL/min；進樣量1-20μL；鍵合相色譜柱；柱溫20-40℃；A和B作為流動相，其中A為甲醇水溶液，B為甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序為0-0.5min，A：97％、B：3％；0.5-3min，A：97～5％、B：3～95％；3-3.01min，A：5-97％、B：95-3％；3.01-11min，A：97％、B：3％；11.01min，A：97％、B：3％；13min，A：97％、B：3％；質譜條件為：采用ESI離子源，正離子MRM掃描，霧化氣流速8-20L/min，氣簾...

【專利技術屬性】
技術研發人員：童鴻斌，
申請(專利權)人：杭州漢庫醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33