本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的來源——經(jīng)血保存液及其應用、經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)方法。利用女性經(jīng)血作為干細胞采集來源，廢物利用，變廢為寶，來源豐富；月經(jīng)血中富含宮內(nèi)膜干細胞的數(shù)量為骨髓的30倍有效成分含量豐富；采用經(jīng)血保存液進行保存，避免經(jīng)血在采集到分離的過程中受外界污染。本發(fā)明專利技術(shù)采用獨特配方的經(jīng)血保存液對經(jīng)血進行保存，顯著降低了經(jīng)血的污染率，同時保證了獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的純度和活力。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物
，特別涉及經(jīng)血保存液及其應用、經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞 的分離培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
子宮是一個具有高度再生及分化能力的組織，每個月經(jīng)周期，女性的子宮內(nèi)膜可 以從0.5_左右增長到5~7mm左右，一個女性一生可以經(jīng)歷400次這樣的循環(huán)。研究表明，子 宮內(nèi)膜中含有干細胞，具有高度的分化潛能，增殖能力以及較低的免疫源性。但是其直接獲 得途徑，包括子宮切除術(shù)、早期妊娠脫膜、刮除術(shù)均對供者具有嚴重侵入性。 近年來，日本科學家在女性經(jīng)血中發(fā)現(xiàn)了具有多向分化潛能的干細胞，該干細胞 可用于修復受損的心肌組織。2008年，美國科學家Patel等發(fā)現(xiàn)，從健康女性經(jīng)血中可分離 出來間充質(zhì)干細胞，這些細胞具有多向分化能力，并將該細胞命名為經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細 胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells JenSCshMenSCs屬于成體干細 胞的一種，具有來源豐富、有效成分含量豐富、收集過程無創(chuàng)、增殖和分化潛能巨大、無倫理 爭論及廢物回收利用等優(yōu)點。同時，研究表明，宮內(nèi)膜干細胞可以用于治療卵巢早衰、子宮 內(nèi)膜疾病、預防衰老等功能，有望成為較為理想的種子細胞。 目前，對于宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)，多采用直接獲得途徑，對患者造成很大的傷 害，同時來源苦難以及受倫理限制等問題;經(jīng)血源干細胞雖有少量研究，但是其無簡單方便 的方法采集經(jīng)血，導致經(jīng)血受污染幾率較高，獲得的干細胞數(shù)量較少，純度較低，分化潛能 較低，同時成本較高、過程復雜等。
技術(shù)實現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術(shù)提供經(jīng)血保存液及其應用、經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)方 法。利用女性經(jīng)血作為干細胞采集來源，廢物利用，變廢為寶，來源豐富；月經(jīng)血中富含宮內(nèi) 膜干細胞的數(shù)量為骨髓的30倍有效成分含量豐富；采用經(jīng)血保存液進行保存，避免經(jīng)血在 采集到分離的過程中受外界污染。本專利技術(shù)采用獨特配方的經(jīng)血保存液對經(jīng)血進行保存，顯 著(P<0.05)降低了經(jīng)血的污染率，同時保證了獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的純度和活力。 為了實現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案： 本專利技術(shù)提供了一種經(jīng)血保存液，包括抗生素、枸櫞酸鈉和肝素鈉。 在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述經(jīng)血保存液中所述抗生素選自青霉素、鏈 霉素或卡那霉素。 在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述經(jīng)血保存液中所述卡那霉素的濃度為30~ 50yg/mL〇 在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述經(jīng)血保存液中所述枸櫞酸鈉的濃度為30~ 50μg/ml〇 在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述經(jīng)血保存液中所述肝素鈉為100U/ml肝素 鈉的磷酸鹽緩沖液。 在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述經(jīng)血保存液包括(2~5) X青霉素、（2~5) X鏈霉素、30~50μg/ml卡那霉素、30~50μg/ml枸櫞酸鈉、100U/ml肝素鈉的磷酸鹽緩沖液。 本專利技術(shù)提供的所述經(jīng)血保存液在保存經(jīng)血中的應用。 本專利技術(shù)還提供了經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟： 步驟1:獲得經(jīng)血;采用所述經(jīng)血保存液保存所述經(jīng)血； 步驟2:取所述經(jīng)血稀釋后獲得經(jīng)血稀釋液，與分離液混合、離心；步驟3:收集上清液清洗后，再與培養(yǎng)基混合，離心； 步驟4:收集沉淀，接種，培養(yǎng)。 在本專利技術(shù)的一些具體實方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟2中所述稀釋為經(jīng)PBS溶液 按照體積比1:1的比例稀釋； 步驟2中所述分離液為Ficoll分離液，所述經(jīng)血稀釋液與所述分離液的體積比為1 :(0.5 ~1); 步驟2中所述離心為于700~800g離心15~30min。 在本專利技術(shù)的一些具體實方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟3中所述清洗為用PBS清洗 2~4次； 步驟3中所述培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。 在本專利技術(shù)的一些具體實方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟4中所述接種的密度為（7 ~8) X105/mL〇 在本專利技術(shù)的一些具體實方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟4中所述培養(yǎng)為48h后半量 換液，72h后全量換液，之后每3d換液1次，7~14d在顯微鏡下觀察到克隆的形成，當細胞生 長至70~80 %匯合時，胰蛋白酶消化。 在本專利技術(shù)的一些具體實方案中，所述分離培養(yǎng)方法所述胰蛋白酶消化為棄去培養(yǎng) 基，清洗，加質(zhì)量濃度為〇. 3~0.5 % (w/w)的胰蛋白酶消化，傳代。在本專利技術(shù)的一些具體實方案中，所述分離培養(yǎng)方法所述消化的時間為2~3min，終 止消化，離心，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。 在本專利技術(shù)的一些具體實方案中，所述分離培養(yǎng)方法所述終止消化采用細胞體積3-5倍量的含5 % FBS的培養(yǎng)基； 所述離心為lOOOrpm離心5min。 在本專利技術(shù)的一些具體實方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟1中獲得的經(jīng)血采用經(jīng)血 保存液保存;所述經(jīng)血保存液包括(2-5) X青霉素、（2-5) X鏈霉素、30~50μg/ml卡那霉素、 30~50μg/ml枸櫞酸鈉、100U/ml肝素鈉的磷酸鹽緩沖液。 在本專利技術(shù)的一些具體實方案中，所述分離培養(yǎng)方法步驟2所述與分離液混合和/或 步驟3中所述清洗采用隔層離心管。 本專利技術(shù)提供了經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟:獲得經(jīng)血;取 所述經(jīng)血稀釋后獲得經(jīng)血稀釋液，與分離液混合、離心；收集上清液清洗后，再與培養(yǎng)基混 合，離心；收集沉淀，接種，培養(yǎng)。利用女性經(jīng)血作為干細胞采集來源，廢物利用，變廢為寶， 來源豐富；月經(jīng)血中富含宮內(nèi)膜干細胞的數(shù)量為骨髓的30倍有效成分含量豐富;采用經(jīng)血 保存液進行保存，避免經(jīng)血在采集到分離的過程中受外界污染。本專利技術(shù)采用獨特配方的經(jīng) 血保存液對經(jīng)血進行保存，顯著(P<〇.05)降低了經(jīng)血的污染率，同時保證了獲得的經(jīng)血源 宮內(nèi)膜干細胞的純度和活力。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)提供的技術(shù)方案具有如下有益效果： 1、利用女性經(jīng)血作為干細胞采集來源，完全是廢物利用，變廢為寶，對供者沒有任 何傷害，安全無痛;來源豐富，每位女性自月經(jīng)初潮至絕經(jīng)，在連續(xù)30多年的時間中，每個月 都有宮內(nèi)膜干細胞的大量生成；同時，月經(jīng)血中富含宮內(nèi)膜干細胞的數(shù)量為骨髓的30倍有 效成分含量豐富。 2、本專利技術(shù)采用專門的經(jīng)血采集套裝采集經(jīng)血，本采集方法更能使供者接受，同時 能夠避免經(jīng)血污染。 3、在采集經(jīng)血時，采用專門的經(jīng)血保存液進行保存，避免經(jīng)血在采集到分離的過 程中受外界污染。 4、本專利技術(shù)采用隔層離心管和細胞貼壁方法相結(jié)合對宮內(nèi)膜干細胞進行分離，并利 用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，操作簡單，成本更低，同時可以得到純度較高、數(shù)量較多、分化能力較 強的經(jīng)血宮內(nèi)膜干細胞。【附圖說明】 為了更清楚地說明本專利技術(shù)實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。 圖1示實施例1制備獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的細胞形態(tài)觀察圖；其中，圖1(A) 示原代培養(yǎng)2天，40倍；圖1(B)示原代培養(yǎng)2天，100倍；圖1(C)示原代培養(yǎng)7天，40倍；圖1(D) 示原代培養(yǎng)7天，100倍； 圖2示對比例制備獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的細胞形態(tài)觀察圖；其中，圖2(A)示 原代培養(yǎng)2天，40倍;圖2(B)示原代培養(yǎng)2天，100倍;圖2(C)示原代培養(yǎng)11天，40倍;圖2(D)示 原代培養(yǎng)11天，1〇〇倍； 圖3示實施例1制備獲得的經(jīng)血源宮內(nèi)膜干細胞的細胞流式本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種經(jīng)血保存液，其特征在于，包括抗生素、枸櫞酸鈉和肝素鈉。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳海佳，王一飛，葛嘯虎，馬巖巖，王小燕，
申請(專利權(quán))人：廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44
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