本發(fā)明專利技術公布了一種變溫調(diào)節(jié)生產(chǎn)耐高溫真菌α-淀粉酶的方法，屬于酶制劑領域。本發(fā)明專利技術采用梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝顯著提高了里氏木霉901-18Trichoderma?reesei?901-18的抗應激能力，致使混合菌種的產(chǎn)酶能力最大限度地顯現(xiàn)，使得本發(fā)明專利技術所產(chǎn)耐高溫真菌α-淀粉酶酶活力高、作用條件寬泛、穩(wěn)定性強、適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于酶制劑制備
，特別是一種耐高溫真菌α-淀粉酶的制備方法。
技術介紹
α-淀粉酶全稱為ct-l，4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉時，可從分子內(nèi)部切開ct -1,4-糖苷鍵而生成糊精和還原糖，由于產(chǎn)物的末端葡萄糖殘基Cl碳原子為α-構型，故得名為α-淀粉酶。常見的Ct-淀粉酶有二種:細菌α-淀粉酶、真菌α -淀粉酶和麥芽α -淀粉酶。細菌Ct-淀粉酶是由細菌如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌等產(chǎn)生的，細菌α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性較強。真菌α -淀粉酶最早于1896年由日本的高峰讓吉從米曲霉中提取，并作為消化劑使用。50年代以來，真菌α-淀粉酶的應用范圍逐漸擴大，開始應用于淀粉制糖、釀造、面包、果蔬飲料、醫(yī)藥和飼料等領域。用于淀粉制糖可以生產(chǎn)出以麥芽三糖為主的新型糖漿；與葡萄糖苷轉移酶合用，可以制備異麥芽低聚糖；在傳統(tǒng)的飴糖、黃酒生產(chǎn)中使用此酶，可以簡化生產(chǎn)工藝，提高原料利用率，節(jié)省糧食，降低生產(chǎn)成本；用于面包制作可以縮短發(fā)酵周期，制成的面包氣孔分布均勻，體積大，保鮮期長，還可替代以往常用的面包添加劑溴酸鉀；用于醫(yī)藥可作為消化劑，代替動物中提取的酶；用于果蔬飲料可以消除渾濁，提高收率；用于飼料可以提高飼料利用率。因此，真菌α-淀粉酶的應用具有廣闊的市場前景。但真菌α -淀粉酶的最適作用溫度在55°C左右，當溫度高于60°C便會逐漸失活，且熱穩(wěn)定相對較低，不適用于較高溫度的反應過程，因此其應用與發(fā)展受到一定程度的限制。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是提供一種變溫調(diào)節(jié)生產(chǎn)耐高溫真菌α -淀粉酶的方法。所述的變溫調(diào)節(jié)生產(chǎn)耐高溫真菌α -淀粉酶的制備方法，其發(fā)酵罐培養(yǎng)階段包括如下步驟:將一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度27_30°C，攪拌速度120-180r/min，通風量(V/V)l:l_3，培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2_5°C，此時，將一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至27_30°C，恒溫培養(yǎng) 15-20h ；補料控制:當發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時，開始添加補料培養(yǎng)基，補料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15_25g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉 l-5g,消泡劑 0.Ι-lg,純凈水 100mL, pH 值 5-6.5，121。。滅菌 20min ；所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25 %，不足部分純凈水補足，pH值5-6.5，121-123°C滅菌30_40min。發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得耐高溫真菌α -淀粉酶。本專利技術所使用的菌株具體為里氏木霉901_18Trichoderma reesei 901-18。該菌株已于2013年11月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:中國.武漢.武漢大學)，保藏號CCTCC N0:M2013602c所述里氏木霉901-18由一株分離自津市市河堤食用菌培植基地土壤樣本的里氏木霉菌株經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得，菌株特點如下:該菌株在PDA固體培養(yǎng)基上生長，形成的菌落特征為菌落呈棉絮狀，菌落呈淡綠色，菌落扁平，高0.2-0.8mm,菌落邊緣白色,整齊；生長速度快，48h菌落直徑達1.5-8.5mm, 72h達30_55mm ；菌絲白色，有隔膜，菌絲壁光滑，直徑在2-5 μ m。分生孢子梗從菌絲的短側枝發(fā)生，側枝上對生。該菌株產(chǎn)真菌ct -淀粉酶的最適pH 3.0-6.5 ;最適溫度為27?30°C。有益效果:1、本專利技術所述的生產(chǎn)耐高溫真菌α-淀粉酶的方法以里氏木霉901-18為菌種，該菌種為首次公開。2、采用本專利技術所述方法生產(chǎn)的耐高溫真菌α -淀粉酶具有如下特點:酶活力高達12000-15000u/ml ;酶溫度適應范圍較寬，為50_75°C之間，最適作用溫度在65°C，70°C下保存3h仍具有80%以上酶活，具有較好的熱穩(wěn)定性和保存活性；該酶最適反應pH值為5.5，在pH值4.5-7.0酶活保持在70%以上。比現(xiàn)有的耐高溫真菌α -淀粉酶酶活力高，酶作用最適pH值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。3、本專利技術中的耐高溫真菌α -淀粉酶在制備過程中由于對培養(yǎng)基實施全程優(yōu)化，采用梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝顯著提高了里氏木霉901-18的抗應激能力，致使菌種的產(chǎn)酶能力最大限度地顯現(xiàn)，使得本專利技術所產(chǎn)耐高溫真菌α-淀粉酶酶活力高、作用條件寬泛、穩(wěn)定性強、適于工業(yè)化生產(chǎn)，具有更好的穩(wěn)定性和保存活性。【具體實施方式】下面通過具體的實施方案敘述本專利技術。除非特別說明，本專利技術中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本專利技術的范圍，本專利技術的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本專利技術實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本專利技術的保護范圍。實施例1:一種變溫調(diào)節(jié)生產(chǎn)耐高溫真菌α -淀粉酶的方法，包括如下步驟:(I)菌種活化將保存完好的里氏木霉901-18的PDA斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng)24h進行菌種活化，如此活化2次；(2)液體種子擴大培養(yǎng)①一級種子培養(yǎng):將步驟(I)活化制成的孢子懸液接入500毫升搖瓶中，使孢子濃度達到15個/mL，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床120r/min，培養(yǎng)溫度27°C，培養(yǎng)時間1h ；②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000 _升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100r/min，培養(yǎng)溫度27°C，培養(yǎng)時間1h ；④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度TVC，攪拌速度200rpm，通風量(V/V) 1:1,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間1h ；所一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，海藻糖1%，硫酸韓Ig,氯化鎂2g,朽1檬酸鈉lg，不足部分純凈水補足，pH值5,121°C滅菌30min。所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%，檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補足，pH值5，121°C滅菌30min。(3)發(fā)酵罐發(fā)酵將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種變溫調(diào)節(jié)生產(chǎn)耐高溫真菌α?淀粉酶的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐發(fā)酵階段具體步驟如下：將發(fā)酵菌種的一級種子罐發(fā)酵液以6％接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度27?30℃，攪拌速度120?180r/min，通風量(V/V)1:1?3,培養(yǎng)時間10?15h；然后以1?2℃/h降溫速率緩慢降溫至10?15℃，恒溫培養(yǎng)15?20h；繼續(xù)以1?2℃/h降溫速率緩慢降溫至2?5℃，此時，繼續(xù)將一級種子罐發(fā)酵液以4％接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20?30h；最后以1?2℃/h升溫速率緩慢升溫至10?15℃，恒溫培養(yǎng)15?20h；繼續(xù)以1?2℃/h升溫速率緩慢升溫至27?30℃，恒溫培養(yǎng)15?20h；補料控制：當發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml?8mg/ml時，開始添加補料培養(yǎng)基，補料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml?5mg/ml；放罐標準：60?80％菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢；發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得耐高溫真菌α?淀粉酶。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：李洪兵，李海清，張錦杰，朱永明，胡永明，李貴駿，
申請(專利權)人：湖南新鴻鷹生物工程有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：湖南;43
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