本發明專利技術涉及真核細胞或生物體中的靶向基因組編輯。更具體地，本發明專利技術涉及用于在真核細胞或生物體中切割靶DNA的組合物及其用途，所述組合物包含特異于靶DNA的向導RNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。
【技術實現步驟摘要】
【專利說明】包含特異于靶DNA的向導RNA和CAS蛋白質編碼核酸或CAS蛋白 質的用于切割靶DNA的組合物及其用途[00011本申請是申請日為2013年10月23日的、專利技術名稱為"包含特異于靶DNA的向導RNA 和CAS蛋白質編碼核酸或CAS蛋白質的用于切割靶DNA的組合物及其用途"的中國專利申請 201380066348.4(PCT/KR2013/009488)的分案申請。
本專利技術涉及真核細胞或生物體中的靶向基因組編輯。更具體地說，本專利技術涉及一 種用于在真核細胞或生物體中切割靶DNA的組合物及其用途，所述組合物包括特異于靶DNA 的向導RNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。
技術介紹
CRISPR(成簇的規律間隔的短回文重復序列）是含有多個短同向重復的基因座，其 被發現存在于約40%測序細菌的基因組中和90%測序古細菌的基因組中。CRISPR作為原核 的免疫系統發揮功能，其賦予對外來遺傳元件例如質粒和噬菌體的抵抗性。CRISPR系統提 供了一種獲得性免疫形式。外源DNA的短片段(稱為間隔區）整合在CRISPR重復序列之間的 基因組中，作為過去暴露的記憶。然后CRISPR間隔區以類似于真核生物中RNAi的方式用于 識別和沉默外來遺傳元件。 Cas9，II型CRISPR/Cas系統中一種重要的蛋白質成分，當與稱為CRISPR RNA (crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的兩個RNA復合時，形成活性核酸內切酶，從而切斷入 侵噬菌體或質粒中的外源遺傳元件，以保護宿主細胞。crRNA從宿主基因組中的CRI SPR元件 轉錄，其中該CRISPR元件之前自外源入侵物捕獲。最近，Jinek等（1)證明，通過融合crRNA和 tracrRNA的必要部分產生的單鏈嵌合RNA可以取代Cas9/RNA復合體中的兩個RNA以形成功 能性核酸內切酶。 CRISPR/Cas系統相對于鋅指和轉錄激活因子樣效應物DNA結合蛋白提供了優 勢--因為在核苷酸結合CRISPR-Cas蛋白中的位點特異性由RNA分子調控而不是DNA結合 蛋白調控(這在設計和合成上是更具挑戰性的）。 然而，到現在為止，尚未開發出使用基于CRISPR/Cas系統的RNA向導核酸內切酶 (RGEN)的基因組編輯方法。 同時，限制性片段長度多態性(RFLP)是最古老，最方便，和最便宜的基因分型方法 之一，其仍然廣泛應用于分子生物學和遺傳學，但其往往受限于缺乏適當的限制性內切酶 識別位點。 可以通過各種方法檢測由工程化核酸酶誘導的突變，其中包括錯配敏感的T7核酸 內切酶I (T7E1)或Surveyor核酸酶測定法，RFLP，熒光PCR產物的毛細管電泳，雙脫氧測序和 深度測序。T7E1和Surveyor測定法廣泛使用，但很繁瑣。此外，這些酶傾向于低估突變頻率， 這是因為突變序列可彼此形成同源雙鏈，從而不能從野生型細胞中區分純合雙等位基因突 變體克隆。RFLP沒有這些限制，因而是首選的方法。實際上，RFLP是檢測細胞和動物中由工 程化核酸酶介導的突變的最早方法之一。然而，不幸的是，RFLP受限于適當限制性位點的可 得性。在所關注的靶位點有可能沒有限制性位點。
技術實現思路
技術問題 到現在為止，尚未開發使用基于CRISPR/Cas系統的RNA向導核酸內切酶(RGEN)進 行基因組編輯和基因分型的方法。 在這種情況下，本專利技術人進行了大量努力來開發基于CRISPR/Cas系統的基因組編 輯方法，最終建立了一個可程序化的RNA向導核酸內切酶，該RNA向導核酸內切酶可以在真 核細胞和生物體中以靶向方式切割DNA。另外，本專利技術人進行了大量努力，開發一種新的在RFLP分析中利用RNA向導核酸內 切酶(RGEN)的方法。其利用RGEN，對癌癥中發現的以及細胞和生物體中由工程化核酸酶(包 括RGEN自身)誘導的頻發突變進行基因分型，從而完成了本專利技術。 技術方案 本專利技術的一個目的是提供一種在真核細胞或生物體中切割靶DNA的組合物，其包 括特異于靶DNA的向導RNA或編碼向導RNA的DNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。 本專利技術的另一個目的是提供一種在真核細胞或生物體中誘導靶向誘變的組合物， 其包括特異于靶DNA的向導RNA或編碼向導RNA的DNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。 本專利技術的另一個目的是提供一種在真核細胞或生物體中切割靶DNA的試劑盒，其 包括特異于靶DNA的向導RNA或編碼向導RNA的DNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。 本專利技術的另一個目的是提供一種在真核細胞或生物體中誘導靶向誘變的試劑盒， 其包括特異于靶DNA的向導RNA或編碼向導RNA的DNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。 本專利技術的再一目的是提供一種制備含有Cas蛋白質和向導RNA的真核細胞或生物 體的方法，所述方法包括用Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質以及向導RNA或編碼向導RNA的 DNA共轉染或順序轉染真核細胞或生物體的步驟。 本專利技術的另一個目的是提供一種真核細胞或生物體，其含有特異于靶DNA的向導 RNA或編碼向導RNA的DNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。 本專利技術的另一個目的是提供一種在真核細胞或生物體中切割靶DNA的方法，所述 方法包括步驟：用組合物轉染含有靶DNA的真核細胞或生物體，所述組合物含有特異于靶 DNA的向導RNA或編碼向導RNA的DNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。 本專利技術的另一個目的是提供一種在真核細胞或生物體中誘導靶向誘變的方法，所 述方法包括步驟:用組合物處理真核細胞或生物體，其中所述組合物含有特異于靶DNA的向 導RNA或編碼向導RNA的DNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。 本專利技術的再一個目的是提供胚胎、基因組修飾的動物或基因組修飾的植物，其包 括由組合物編輯的基因組，所述組合物含有特異于靶DNA的向導RNA或編碼向導RNA的DNA和 Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。 本專利技術的另一個目的是提供一種制備基因組修飾的動物的方法，所述方法包括步 驟:將含有特異于靶DNA的向導RNA或編碼向導RNA的DNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質 的組合物，引入動物胚胎中；和將胚胎轉移到假孕代母的輸卵管中，以產生基因組修飾的動 物。本專利技術的另一個目的是提供一種組合物，其用于在分離的生物樣品中基因分型突 變或變異，所述組合物包含特異于靶DNA序列的向導RNA和Cas蛋白質。本專利技術的另一個目的是提供一種使用RNA向導核酸內切酶(RGEN)對細胞中由工程 化的核酸酶誘導的突變或天然存在的突變或變異進行基因分型的方法，其中所述RGEN包含 特異于靶DNA的向導RNA和Cas蛋白質。本專利技術的另一個目的是提供對細胞中由工程化的核酸酶誘導的突變或天然存在 的突變或變異進行基因分型的試劑盒，所述試劑盒含有RNA向導核酸內切酶(RGEN)，其中所 述RGEN含有特異于靶DNA的向導RNA和Cas蛋白質。 本專利技術的一個目的是提供在真核細胞或生物體中切割靶DNA的組合物，所述組合 物含有特異于靶DNA的向導RNA或編碼向導RNA的DNA和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。 本專利技術的另一個目的是提供在真核細胞或生物本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種在真核細胞或生物體中切割靶DNA的組合物，其包含特異于靶DNA的向導RNA或編碼向導RNA的DNA、和Cas蛋白質編碼核酸或Cas蛋白質。
【技術特征摘要】
...
【專利技術屬性】
技術研發人員：金進秀，曹承于，金素貞，J·M·金，金爽中，
申請(專利權)人：基因工具股份有限公司，
類型：發明
國別省市：韓國;KR
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