本發(fā)明專利技術(shù)提供了楸樹(shù)扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR2的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。利用70對(duì)SSR分子標(biāo)記確定楸樹(shù)87份無(wú)性系材料的基因型結(jié)合其扦插生根率進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)連鎖分析，檢測(cè)到楸樹(shù)扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR2，解釋19.15%表型變異，SSR分子標(biāo)記CB121與之極顯著相關(guān)。本發(fā)明專利技術(shù)不但有助于解決我國(guó)楸樹(shù)育種進(jìn)展遲緩的問(wèn)題，而且有助于解決現(xiàn)有育種技術(shù)對(duì)提高楸樹(shù)扦插生根率成本高、時(shí)間長(zhǎng)、穩(wěn)定性低等技術(shù)難題，將加快我國(guó)楸樹(shù)新品種培育與無(wú)性系林業(yè)發(fā)展。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)提供了揪樹(shù)桿插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR2的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳 學(xué)領(lǐng)域，專用于定向培育桿插易生根的揪樹(shù)新品種。
技術(shù)介紹
揪樹(shù)（仍紅如a/wwei)屬于紫蔵科（仿如口打iaceae)梓屬（仍紅如a)的優(yōu)良珍貴 用材樹(shù)種。隨著工業(yè)的發(fā)展和世界人口的增長(zhǎng)、木材需求與日劇增，木材短缺已成為世界性 問(wèn)題，我國(guó)尤為突出。發(fā)展無(wú)性系林業(yè)成為緩解我國(guó)木材短缺問(wèn)題的有效途徑，而桿插生根 率是制約無(wú)性系林業(yè)發(fā)展的瓶頸。揪樹(shù)為桿插生根率低的樹(shù)種，桿插生根困難限制了揪樹(shù) 無(wú)性系林業(yè)的發(fā)展。因此挖掘與桿插生根率相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)培育桿插易生根的揪樹(shù)新品 種具有重要的意義。 SSR分子標(biāo)記是目前應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一，被廣泛的應(yīng)用于基因定 位、Q化定位、標(biāo)記輔助育種和遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等方面。陳永霞等（陳永霞，張新 全，馬嘯，謝文剛.SSR標(biāo)記與扁穗牛鞭草農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011， 50 (7) : 1494-1498.)選用10對(duì)SSR引物對(duì)44份外部形態(tài)差異較大的扁穗牛鞭草進(jìn)行掃描， 進(jìn)行性狀與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，其中找到18個(gè)SSR標(biāo)記與8個(gè)農(nóng)藝性狀顯著相關(guān)，并篩 選出優(yōu)異種質(zhì)，加快扁穗牛鞭草的育種進(jìn)程。 前期研究發(fā)現(xiàn)不同揪樹(shù)無(wú)性系間桿插生根能力存在顯著差異，根據(jù)生根率、單株 生根數(shù)和單株最長(zhǎng)根長(zhǎng)等3個(gè)指標(biāo)可W將其分為生根能力較差、生根能力中等、生根能力 較好和易生根類等4個(gè)組（馬玲玲，王鵬，張振宇，李林芳，楊如同，李亞.梓屬植 物嫩枝桿插生根能力的評(píng)價(jià).北方園藝，2014，（15): 72-77.)。該研究結(jié)果表明利用此 群體開(kāi)展關(guān)聯(lián)分析，可能檢測(cè)到桿插生根率相關(guān)的的'L位點(diǎn)或分子標(biāo)記。目前還未見(jiàn)開(kāi)展 相關(guān)研究的論文或?qū)＠?br>技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
陽(yáng)0化]本專利技術(shù)的目的是提供揪樹(shù)桿插生根率主效9化位點(diǎn)及其分子標(biāo)記。 本專利技術(shù)的目的是通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：利用SSR分子標(biāo)記引物CB121的正向 引物序列 5' -CCCTTCCTCTCTGCTCCTCT-3' 和反向引物序列 5' -AGACGATGACGAGGGTTTTG-3' 結(jié)合PCR技術(shù)擴(kuò)增揪樹(shù)嫩葉的基因組DNA，如果能擴(kuò)增出145bp的DNA片段，則標(biāo)志著揪 樹(shù)桿插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR2的存在，利用TASS化2. 1軟件的化Μ程序測(cè)得對(duì)揪樹(shù)桿插 生根率的貢獻(xiàn)率為19. 15%。 有益效果：本專利技術(shù)首次公布了一個(gè)揪樹(shù)桿插生根率的主效的'L位點(diǎn)及其分子標(biāo) 記，該標(biāo)記將有利于縮短揪樹(shù)的育種周期，降低育種成本，定向培育桿插生根率高的揪樹(shù)品 種，進(jìn)而加速揪樹(shù)的推廣，最終為在緩解我國(guó)的優(yōu)質(zhì)木材短缺的問(wèn)題上發(fā)揮重要的作用。【具體實(shí)施方式】 揪樹(shù)桿插生根率統(tǒng)計(jì)分析：2013年3月上旬和2014年3月上旬，將87個(gè)揪樹(shù)無(wú) 性系的五年生枝條截成30cm長(zhǎng)后均勻地邸置于平整的沙床內(nèi)，然后覆蓋3~5cm的細(xì)沙， 誘透水。每周用500倍的多菌靈濁液噴灑誘透沙床。將泥炭和珍珠巖按1:1的體積比混勻 后裝進(jìn)育苗盆(規(guī)格為15X15X20 cm)中并用500倍的多菌靈濁液噴灑誘透。當(dāng)沙床內(nèi)新 萌發(fā)的嫩枝高度達(dá)到10~15cm時(shí)，去掉嫩枝的頂端，一周后，將嫩枝帶遲取下，作為插穗。 將插穗上的葉片連同葉柄一起剪掉，只剩頂部的一片葉子，并將其剪掉一半。將處理好的插 穗基部浸薩75%的酒精消毒30s，用清水沖洗干凈，然后在3, 000 mg/L的IBA中浸薩Imin， 將插穗插入育苗盤，每個(gè)穴杯插1根，深度為插穗長(zhǎng)度的1/2~2/3。每個(gè)無(wú)性系桿插20個(gè) 插穗，重復(fù)3次。桿插完之后用85%遮陰網(wǎng)遮蓋防曬，自動(dòng)噴霧裝置噴霧給水。每周用500 倍的多菌靈濁液噴灑誘透。桿插后70天統(tǒng)計(jì)各無(wú)性系生根率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)揪樹(shù)不同無(wú)性系間 的生根率差異極大，生根率變幅為10. 06%~95. 80%。 揪樹(shù)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析：利用CTAB法提取揪樹(shù)嫩葉基因組DNA，然后用277對(duì)SSR 引物隨機(jī)PCR擴(kuò)增12個(gè)揪樹(shù)無(wú)性系DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70對(duì)引物可W成功的擴(kuò)增出條帶清晰 且多態(tài)性好的條帶，合成引物的可用性為25. 26%。70對(duì)SSR引物的多態(tài)性頻率介于40%~ 100%，平均的多態(tài)性頻率為87. 17%，多態(tài)性豐富(表1)。SSR引物由南京思普金生物科技 有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為10μL包括20ng基因組DNA，2. 5mM的MgC12,0. 5mM的 dNTPs，20ng的引物，0. 5U化qDNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變 性30秒，57°C退火45秒，72°C延伸60秒，循環(huán)32次，最后72°C延伸5分種。PCR反應(yīng) 在伯樂(lè)T100PCR儀上完成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：利用8%濃度的聚丙締酷胺凝膠電泳，進(jìn)行 PCR產(chǎn)物檢測(cè)，上樣量為1. 5化，電泳緩沖液為1XTBE，電壓設(shè)為220V，電泳至漠酪藍(lán)帶跑 出膠最低端為止。膠片用銀染方法染色：先用固定液(去離子水、10%乙醇、1%乙酸)固定10 min,再1. 5%硝酸銀溶液浸泡10min,去離子水迅速洗涂2遍后，顯色液(去離子水、1. 5%氨 氧化鋼、1%甲醒）顯色10min,最后用去離子水沖洗，放入膠片觀察燈上拍照。W二進(jìn)制記 錄SSR引物擴(kuò)增結(jié)果，同一位點(diǎn)上具有相同遷移率的條帶記為1，無(wú)帶記為0,獲得87個(gè)揪 樹(shù)無(wú)性系的基因型數(shù)據(jù)。利用Structure2.1軟件結(jié)合基因型數(shù)據(jù)對(duì)梓屬群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行 分析，結(jié)果表明對(duì)應(yīng)似然值InP(D)隨K值的增大而持續(xù)增大，因此參照Evanno等巧vanno G,民egnautS,GoudetJ.Detectingthenumberofclustersofindividualsusing 化esoftwareSTRUCTU肥：asimulations化dy.Molecularecology, 2005，14 巧）： 2611-2620.)通過(guò)ΔK來(lái)確定K值。ΔK在K=7時(shí)出現(xiàn)峰值，所W87份揪樹(shù)材料可被分為 7個(gè)亞群。將Κ=7代入structure軟件重新運(yùn)算，得到各個(gè)材料的對(duì)應(yīng)Q值，作為下一步生 根性狀與SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析的協(xié)變量，可W有效降低群體結(jié)構(gòu)對(duì)關(guān)聯(lián)分析的影響。 揪樹(shù)連鎖不平衡分析：通過(guò)對(duì)70個(gè)SSR標(biāo)記486個(gè)位點(diǎn)分析，表明在117, 855個(gè) 成對(duì)組合的SSR位點(diǎn)中，存在一定程度的LD。統(tǒng)計(jì)概率（P< 0. 01)支持的LD成對(duì)位點(diǎn) 77, 106個(gè)，占全部位點(diǎn)組合的65. 42%，平均值為0. 557,值在0. 4W上的LD位點(diǎn)組合數(shù)為 42, 523,占總LD位點(diǎn)組合數(shù)的55. 15%，其中位于0. 8-1之間的位點(diǎn)數(shù)最多，有29, 667個(gè)，W 上均說(shuō)明位點(diǎn)間整體LD水平較高。 揪樹(shù)桿插生根率的關(guān)聯(lián)分析：利用TASS化2. 1軟件的GLM程序W87個(gè)無(wú)性系對(duì)應(yīng) 的Q值為協(xié)變量，將70個(gè)SSR標(biāo)記與生根率進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果檢測(cè)到6個(gè)桿插生根 率的9化，分別命名為qRRl~qRR6。9化位點(diǎn)qRR2緊密連鎖的標(biāo)記為CB121，解釋的表型變 異率為19. 15%。CB121的正向引物序列是：5' -CCCTTCCTCTCTGCTCCTCT-3'，反向引物序列 為：5' -AGACGATGACGAGGGTTTTG-3本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
楸樹(shù)扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR2的分子標(biāo)記方法，其特征在于：利用SSR分子標(biāo)記引物CB121的正向引物序列5’?CCCTTCCTCTCTGCTCCTCT?3’和反向引物序列5’?AGACGATGACGAGGGTTTTG?3’結(jié)合PCR技術(shù)擴(kuò)增楸樹(shù)嫩葉的基因組DNA，如果能擴(kuò)增出145?bp?的DNA片段，則標(biāo)志著楸樹(shù)扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR2的存在，利用TASSEL2.1軟件的GLM程序測(cè)得對(duì)楸樹(shù)扦插生根率的貢獻(xiàn)率為19.15%。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王鵬，楊如同，李林芳，李亞，馬玲玲，王淑安，汪慶，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：江蘇;32
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