一種帶電荷納米結構細胞芯片的制備及應用方法技術

本發(fā)明專利技術涉及一種帶電荷納米結構細胞芯片的制備及應用方法，用于細胞高效檢測，屬于功能材料、生物醫(yī)學材料及檢測分析技術領域。本發(fā)明專利技術是將潔凈的透明基片置于火焰上,在基片的表面進行物理沉積，得到由納米煙灰顆粒組成的煙灰層,對煙灰基底進行水蒸氣沉積，以此為模板，采用含硅化合物進行化學氣相沉積,在煙灰顆粒的表面沉積一層二氧化硅外殼層；然后通過高溫煅燒,將納米煙灰顆粒除去,得到具有納米結構的二氧化硅層；最后，將帶有氨基或羧基的化學試劑修飾在所述的二氧化硅層的表面，得到用于細胞檢測的帶電荷的納米結構細胞芯片。本發(fā)明專利技術的帶電荷的細胞芯片制備方法簡單，具有良好的光學性能，高效的捕獲率和粘附率。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于納米材料制備，功能材料，生物醫(yī)學材料以及檢測分析
，特別涉及到具有三維拓撲結構帶電荷的二氧化硅納米結構細胞芯片的制備方法。
技術介紹
隨著科技的發(fā)展，尤其是工業(yè)化進程的推進，人們的物質(zhì)水平得到了很大的改善，然而任何事情均具有兩面性，是一把雙刃劍。與此同時，環(huán)境問題也逐漸成為大家街頭巷議的焦點，環(huán)境的污染程度令每個人都不寒而栗，霧霾等環(huán)境問題成了大家在健康領域的極大阻力。生活其中，很多疾病應運而生，尤其是各式各樣的癌癥，奪去了很多人的生命。然而很多疾病發(fā)現(xiàn)之時，卻已是中后期，或者晚期。因此，如何及早發(fā)現(xiàn)，及早治療，防患于未然，或者是防微杜漸，成為了醫(yī)學界的熱門話題。一般認為，一些腫瘤細胞的檢測分析可以有效地應用于早期的診斷治療，以及藥物的療效評估，包括像臨床篩藥，檢測藥物耐藥性等，或者檢測腫瘤是否復發(fā)，以及研發(fā)一些新的治療藥物等等，隨著現(xiàn)代檢測技術的應用，科學家和醫(yī)學家們也研發(fā)了許許多多用于細胞富集以及檢測的方法和技術，例如，基于尺寸大小的膜過濾法，免疫磁珠的分離方法等等，然而還有很多問題具有很大挑戰(zhàn)和機遇。因為人體血液中的癌細胞數(shù)量非常的少，處于痕量的級別，大約每幾億的正常細胞中才發(fā)現(xiàn)一個癌變的腫瘤細胞，對其檢測的方法和技術要求非常高，并且儀器也要具備很好的靈敏性才可以高效的檢測分析到目標。并且，檢測到的癌細胞還要具有生物活性，以便進行后續(xù)的分析研究。因此，尋找用于檢測癌細胞的既簡潔又靈敏的方法，成了眾多醫(yī)學家追逐的目標和亟待解決的問題。眾所周知，細胞表面成有一定的電負性，究其原因，不同生物學家和醫(yī)學家從不同的角度都給予的充分的解釋，大家都能接受并且最為直觀的解釋，就是從組成結構分析，因為細胞膜是由磷脂雙分子層的結構作為支架而構成，親水的磷酸集團在外面，疏水的脂肪酸在里面，磷酸基團帶負電。除了磷脂，糖醛酸也是產(chǎn)生負電荷的重要原因，還有聚陰離子寡糖在細胞膜上也有分布。因此，當用于檢測的基底表面由帶有氨基官能團的化學物質(zhì)修飾后得到帶正電荷的細胞芯片，其對細胞的粘附效率就會有所增加；而當用于檢測細胞的基底由羧基進行化學修飾后得到帶負電荷的細胞芯片，其對細胞的粘附效率自然會有所下降。因此，尋找研發(fā)具有氨基修飾的生物材料，在癌細胞高效靈敏地檢測分析領域，對科學家和醫(yī)學家而言，都具有非常廣闊的發(fā)展前景。
技術實現(xiàn)思路
為了解決以往對癌細胞粘附檢測分析效率比較低的現(xiàn)狀，本專利技術的應用材料在于克服已有技術的不足，提出了在三維拓撲納米結構表面修飾氨基官能團的帶正電荷的細胞芯片，繼而能夠較好的粘附、檢測、分析癌細胞的生物醫(yī)學材料。從而使癌細胞能夠高效靈敏地被醫(yī)學家和科學家檢測分析，最終應用于醫(yī)生對患者的診斷治療，造福千千萬萬的癌癥患者，甚至于其他病患身上，為大家的健康保駕護航。—種帶電荷納米結構細胞芯片的制備方法，其特征在于:(1).細胞芯片的基底為三維二氧化硅納米結構；(2).細胞芯片基底表面通過不同厚度的煙灰層來制備；(3).細胞芯片基底表面用帶有氨基的功能化試劑修飾，得到帶正電荷細胞芯片；(4).細胞芯片基底表面由帶有羧基的功能化試劑來修飾，得到帶負電荷細胞芯片;(5).由氨基官能團修飾的細胞芯片，細胞粘附數(shù)量較多；由羧基修飾的細胞芯片，細胞粘附數(shù)量較少。本專利技術具體制備步驟如下:(1)在細胞芯片的玻璃基底表面制備煙灰層:將玻璃基底表面依次用丙酮、乙醇、去離子水等進行超聲清洗，待清洗干凈之后再用氮氣吹干。然后將干凈的細胞芯片基底置于平穩(wěn)燃燒的火焰上方，均勻的左右移動，控制不同的時間，可以得到不同厚度的煙灰層。(2)高溫煅燒細胞芯片基底，生成二氧化硅納米結構:將表面生成二氧化硅納米結構的細胞芯片基底，置于潮濕的密閉空間中，在水蒸氣作用下進行氣相沉積，使水分子附著在煙灰表面。然后再將其置于密閉的充滿含硅化合物的容器中進行氣相沉積。當反應完成之后，將其置于馬弗爐中，進行高溫煅燒。首先經(jīng)過4-5個小時，進行升溫至600度，然后保持這個溫度兩個小時，之后讓其自然冷卻至室溫，以備后續(xù)實驗所用。(3)將具有二氧化硅納米結構的細胞芯片基底分別修飾氨基官能團、羧基官能團:將含有二氧化硅納米結構的細胞芯片基底經(jīng)過氧等離子體plasma處理，然后浸沒于體積濃度4%的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液當中，過夜修飾12個小時，然后乙醇清洗，二甲基亞砜(DMS0)清洗，然后浸沒于濃度為2mM的N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸的二甲基亞砜溶液，或者濃度為2mM的3-馬來酰亞胺基丙酸的二甲基亞砜溶液當中，常溫下放置6h，之后取出用磷酸緩沖液進行清洗2-3遍，繼而得到用于細胞檢測的細胞芯片。所述細胞芯片的載體包括有玻璃、石英、硅片等。細胞芯片的二氧化硅納米結構可以具有不同厚度的煙灰層，主要是將基片在火焰上方，控制不同的時間，5-15秒。細胞芯片在火焰上的時間越短，煙灰層就越薄；時間越長，煙灰層就越厚。煙灰所用的火焰來自于植物油脂，動物油脂，酒精燈，或者蠟燭。本專利技術在細胞芯片的表面進行細胞粘附檢測，以及熒光拍攝的具體步驟是將基底置于濃度105/ml的3T3細胞懸浮液當中，然后放在培養(yǎng)箱中15?120分鐘；將已經(jīng)粘附癌細胞的基底用多聚甲醛進行固定，磷酸緩沖液PBS清洗，Triton X-100穿膜，PBS清洗，4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)，染色 PBS 清洗；之后用 Nikon 焚光顯微鏡進行拍攝。本專利技術的帶電荷的細胞芯片制備方法簡單，具有良好的光學性能，高效的捕獲率和粘附率。【附圖說明】:圖1是本專利技術用于細胞檢測的納米二氧化硅基底的正面的掃描電子顯微鏡圖。圖2是本專利技術用于細胞檢測的納米二氧化硅基底的側面的掃描電子顯微鏡圖。圖3是本專利技術帶正電荷的細胞芯片粘附細胞的環(huán)境掃描電子顯微鏡圖。圖4是實施案例1由氨基修飾的帶正電荷的細胞芯片和實施案例2由羧基修飾的帶負電荷的細胞芯片分別檢測細胞數(shù)目的對比圖。【具體實施方式】實施例對本專利技術的技術方案進一步說明實施例1:取實驗室所用的普通載玻片，切成lcmX lcm的正方形，將玻璃片浸泡在“食人魚”溶液(98% H2S04^P 30% H 202，比例為3:1)中，放置在200°C的加熱板上，加熱1小時左右，取出后分別用丙酮超聲15min、乙醇超聲15min、去離子超聲lOmin，然后用氮氣吹干。將清洗好的載玻片放置在平穩(wěn)的蠟燭火焰上方，左右均勻移動15s，即可以得到具有多孔網(wǎng)狀結構的較厚煙灰層。將得到的樣品置于六孔板的五個孔中，其中一個孔加入3mL的去離子水，將六孔板進行密封，室溫放置一個小時。待煙灰層吸附水蒸氣完畢之后，打開六孔板，取出玻璃片，放置于培養(yǎng)皿中，(玻璃片的下面墊一層載玻片)，在培養(yǎng)皿旁邊加入100微升四氯化硅溶液(SiCl4)，密封保存，室溫下放置一個小時，使水蒸氣和四氯化硅發(fā)生水解作用，生成的Si02包覆在煙灰顆粒外，形成Si02外殼。把得到的樣品放在馬弗爐中，調(diào)整程序設置，使其經(jīng)過5個小時升至60(TC，然后保持加熱2小時，最后自然冷卻，如此便可得到具有多孔網(wǎng)狀結構的Si02納米結膜層。將制備好的具有二氧化硅納米結構的玻璃片基底進行氧等離子體設備處理(即打plasma)，等離子體本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種帶電荷納米結構細胞芯片的制備方法，其特征在于：(1).細胞芯片的基底為三維二氧化硅納米結構；(2).細胞芯片基底表面通過不同厚度的煙灰層來制備；(3).細胞芯片基底表面用帶有氨基的功能化試劑修飾，得到帶正電荷細胞芯片；(4).細胞芯片基底表面由帶有羧基的功能化試劑來修飾，得到帶負電荷細胞芯片；(5).由氨基官能團修飾的細胞芯片，細胞粘附數(shù)量較多；由羧基修飾的細胞芯片，細胞粘附數(shù)量較少。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：許利蘋，張帥濤，陳艷霞，楊高，張青青，王樹濤，張學記，
申請(專利權)人：北京科技大學，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11