納米金修飾的石墨烯用于蛋白質N末端分離的方法技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，具體為一種納米金修飾的石墨烯用于蛋白質N末端分離的方法。本發明專利技術方法步驟為，首先合成納米金修飾的石墨烯（G@PDA@Au），再對氨基封閉后的蛋白進行酶解，對酶解液進行巰基衍生后，利用G@PDA@Au對衍生上巰基的非N末端肽段進行去除，最后利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行蛋白質N末端的檢測。本發明專利技術方法可以方便高效地去除非N末端肽段，提高蛋白質N末端肽段鑒定效果。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及一種利用納米金修飾的材料用于蛋白質N末端分離的方法。
技術介紹
蛋白質N末端的氨基酸起點常與數據庫中的起始位點不同。蛋白質在翻譯和加工過程中，N端可能涉及到RNA的剪切，多種可選的翻譯起點，信號肽的切割，以及各種化學層面的翻譯后修飾等過程，而導致蛋白質N末端的復雜性。鑒定蛋白質N末端序列對于理解蛋白質的生物功能等具有重要意義。目前，蛋白質N末端的方法主要基于正向富集和反向去除策略。正向富集策略的主要原理是先在蛋白質N末端引入特異性基團，經胰蛋白酶酶切后，蛋白變成肽段，再利用相應的材料對蛋白質N末端進行特異性地分離。反相去除策略主要原理是先在蛋白質層面進行所有的氨基全封閉，經過胰蛋白酶酶切后，蛋白變成肽段，再利用非N末端肽段上的游離氨基，結合氨基反應材料去除非N末端肽段，并對蛋白質N末端肽段進行分離富集。反相去除方法相較正向富集方法，有望富集到更多因化學修飾而導致游離氨基封閉的N末端，然而，去除材料的效率相對略有不足。因此，許多研究合成不同的可離去基團修飾的材料，包括三氟乙磺酸基材料等，利用氨基的親核性對非N末端肽段進行去除。為進一步提高非N末端肽段去除效率，需要探索更高效的去除材料。有文獻表明，利用特勞特試劑(Traut’s Reagent)可以對氨基進行高效快速的巰基衍生，而同時，利用金和硫可以在溫和的條件下形成牢固的金硫鍵。巰基衍生和金硫鍵形成均為加成反應，因此，體系中不會引入多余的鹽類，減少除鹽過程中樣品損失，且不影響質譜的鑒定。若體系中的非N末端肽段可以得到高效的巰基衍生并被金修飾的材料分離，則可以實現蛋白質N末端的高效分離鑒定。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種納米金修飾的石墨烯用于蛋白質N末端分離的方法。本專利技術提供的納米金修飾的石墨烯用于蛋白質N末端分離的方法，具體步驟為: 首先，合成納米金修飾的石墨稀(GOPDAOAu)； 然后，對蛋白上的所有游離氨基進行封閉，再對封閉蛋白進行溶液酶解； 然后，用特勞特試劑對非N末端肽段進行巰基衍生，加入納米金修飾的石墨烯對含巰基的非N末端肽段進行分離富集； 最后，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALD1-ToF)進行蛋白質N末端的檢測。本專利技術中，所述合成納米金修飾的石墨稀的具體步驟如下: (1)取一定質量石墨烯分散在10 mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室溫下攪拌4-12 h ; (2)將多巴胺包覆的石墨烯(GOPDA)經離心后，用水和乙醇交替洗滌數次，再在真空下烘干4-16 h ; (3)取一定質量G0PDA分散在50-100ml水中，加入終濃度為0.1-0.5 mM無水合氯金酸，加熱至85-90°C后，加入5-10 mM檸檬酸三鈉，保持加熱1小時以上(一般為1_2小時)，經離心，用水和乙醇交替洗滌數次后，用真空干燥，得到納米金修飾的石墨烯。本專利技術中，所述對蛋白上的所有游離氨基進行封閉，再對封閉蛋白進行溶液酶解的具體步驟日下； (4)將蛋白溶于高濃度(一般為4Μ以上，如為4 Μ-10Μ)鹽酸胍中，用等體積40-100 mM三乙胺碳酸氫鹽稀釋后，5-8 mM 二硫蘇糖醇，60°C以上(一般為60-80°C )反應至少0.5小時(一般為0.5-1小時)后，再加入2-2.5倍濃度(相較于二硫蘇糖醇)的碘乙酰胺，閉光反應0.5-1小時，再加入20-60 mM甲醛和10-30 mM氰基硼氫化鈉反應4_16小時； (5)用三乙胺碳酸氫鹽(pH7.2-8.5)對蛋白進行溶液置換，并重復2次以上(一般為2-3次)置換動作，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量為蛋白的2.5%-5%，進行過夜酶解； 本專利技術中，所述用特勞特試劑對非N末端肽段進行巰基衍生，加入納米金修飾的石墨烯對含巰基的非N末端肽段進行分離富集的具體步驟為； (6)取一單位質量蛋白酶解液加入0.2-20倍單位質量特勞特試劑，20-60°C下反應0.5小時以上或過夜； (7)在上述混合液中加入200-600倍質量的GOPDAOAu，20-60°C下反應1.5-2.5 h，取上清液。最后進入基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行分析鑒定。本專利技術中，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析與常規分析相同，具體步驟為，取0.1 yg蛋白酶解液于革巴板上，再在蛋白革巴點上添加1 yL 4 mg/ml α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質，待液體干燥后，進入機器進行分析。利用本專利技術方法可以實現蛋白質N末端肽段高效快速地分離。【附圖說明】圖1為GOPDAOAu透射電鏡圖。圖2為實驗流程示意圖。圖3為人血漿白蛋白經氨基封閉后酶解液非N末端肽段去除前后MALD1-ToF圖。【具體實施方式】實施例1: 一種納米金修飾的石墨烯用于蛋白質N末端分離的方法，具體步驟如下: (1)取一定質量石墨烯分散在10mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室溫下攪拌4-12 h ; (2)將多巴胺包覆的石墨烯(G0PDA)經離心后，用水和乙醇交替洗滌數次，再在真空下烘干4-16 h ; (3)取一定質量G0PDA分散在50-100ml水中，加入0.25 mM無水合氯金酸，加熱至85°C后，加入10 mM檸檬酸三鈉，保持加熱1 h后，經離心，用水和乙醇交替洗滌數次后，用真空干燥待用； (4)將人血漿白蛋白溶于6Μ鹽酸胍中，用等體積50 mM三乙胺碳酸氫鹽稀釋后，5 mM二硫蘇糖醇，60°C反應45分鐘后，再加入12.5 mM的碘乙酰胺，閉光反應一小時，再加入40mM甲醛和20 mM氰基硼氫化鈉反應6小時； (5)用25mM三乙胺碳酸氫鹽對蛋白進行溶液置換，并重復2次置換動作，加入2.5%胰蛋白酶，進行過夜酶解； (6)取10μ g蛋白酶解液加入0.5倍質量特勞特試劑，60°C下反應1.5 h ; (7)在上述混合液中加入200-400倍質量的G@PDA@Au，60°C下反應2.5 h，取上清液，進入基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行分析鑒定，得到人血漿白蛋白N末端肽段1205.5 Da0實施例2: 一種納米金修飾的石墨烯用于蛋白質N末端分離的方法，具體步驟如下: (1)取一定質量石墨烯分散在10mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室溫下攪拌4-12 h ; (2)將多巴胺包覆的石墨烯(G0PDA)經離心后，用水和乙醇交替洗滌數次，再在真空下烘干4-16 h ; (3)取一定質量G0PDA分散在50-100ml水中，加入0.25 mM無水合氯金酸，加熱至85°C后，加入10 mM檸檬酸三鈉，保持加熱1 h后，經離心，用水和乙醇交替洗滌數次后，用真空干燥待用； (4)將牛血漿白蛋白溶于6Μ鹽酸胍中，用等體積50 mM三乙胺碳酸氫鹽稀釋后，5 mM二硫蘇糖醇，60°C反應45分鐘后，再加入12.5 mM的碘乙酰胺，閉光反應一小時，再加入40mM甲醛和20 mM氰基硼氫化鈉反應6小時； (5)用25mM三乙胺碳酸氫鹽對蛋白進行溶液置換，并重復2次置換動作，加入2.5%胰蛋白酶，進行過夜酶解； (6)取10μ g蛋白酶解液加入0.5倍質量特勞特試劑，60°C下反應1.5 h ; 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種納米金修飾的石墨烯用于蛋白質N末端分離的方法，其特征在于，具體步驟為：首先，合成納米金修飾的石墨烯；然后，對蛋白上的所有游離氨基進行封閉，再對封閉蛋白進行溶液酶解；然后，用特勞特試劑對非N末端肽段進行巰基衍生，加入納米金修飾的石墨烯對含巰基的非N末端肽段進行分離富集；最后，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行蛋白質N末端的檢測。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張祥民，李蘭婷，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發明
國別省市：上海;31