一種工程化有機磷水解酶、核酸和突變體及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種工程化有機磷水解酶、核酸和突變體及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明專利技術的工程化有機磷水解酶，是如SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第262位氨基酸殘基中的一位或者多位經過氨基酸替換后形成的新氨基酸序列組成的活性提高的有機磷水解酶突變體。與現有技術相比，本發明專利技術中的有機磷水解酶突變體對馬拉硫磷的催化活性提高了36.7倍，同時該突變體保持了母本優良的熱穩定性，50℃半衰期達65h。本發明專利技術中的有機磷水解酶突變體能夠高效降解馬拉硫磷等常見有機磷農藥，熱穩定性佳，在降解有機磷農藥領域具有很好的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物工程
，尤其是設及一種有機憐水解酶、突變體及其編碼 基因，W及該有機憐水解酶及其突變體在有機憐農藥降解中的應用。
技術介紹
我國是農藥生產和使用大國。全國約有2000多家農藥生產企業，生產農藥種類超 過200種。有機憐農藥具有價格低廉、高效、廣譜等特點，是廣泛生產、應用的殺蟲劑，占據 世界殺蟲劑市場38%的份額。2010年國內農藥總產量為226. 22萬噸，其中有機憐農藥產 品占到總量的80%。在我國，農藥年使用量高達80-100萬噸，居世界首位。盡管有機憐農 藥有效防治了農作物病蟲害，顯著提高了農作物的產量，但長期和大量的使用給食品安全 W及生態環境帶來了許多負面的影響。2012年，對9個品牌18種國內常見的中檔茶葉調查 發現所有樣品均有多種農藥殘留。農田噴灑的農藥除了少量被農作物吸收，大量農藥聚集 在±壤中，并通過降雨、排水等途徑進入大氣和湖泊，造成±壤、大氣污染和水體生態的嚴 重破壞。對硫憐、甲基對硫憐、內吸憐、馬拉硫憐、樂果、毒死婢等有機憐農藥是我國生活飲 用水的農藥檢測項目。據統計，我國被農藥污染的±壤已達1300-1600萬公頃，經濟損失超 過十億元，農藥的污染已經十分嚴重，降解高毒有機憐農藥的工作刻不容緩。其中，W微生 物或酶制劑為代表的生物降解和修復技術由于其高效率、低成本和環境友好等特點，顯示 出廣闊的前景。根據農業部禁用高毒農藥的1586號公告，我國自2011年10月31日起，全面停止 包括甲基對硫憐、苯線憐、地蟲硫憐、甲基硫環憐、硫線憐、蛹毒憐、治懼憐、特下硫憐等在內 的高毒有機憐農藥的生產，并在2013年10月31日起停止其銷售和使用。因此，毒性相對 較小的馬拉硫憐、樂果、殺懼硫憐等農藥的生產量與使用量日益增長，成為廣泛使用的有機 憐類農藥。其中馬拉硫憐也是目前美國使用量最大的有機憐農藥，適用于防治煙草、茶、蔬 菜、棉花和谷物等作物上的害蟲，也可作為室內殺蟲劑防治倉庫害蟲，使用范圍廣泛。盡管 毒性相對較低，但接觸后仍可造成嚴重的中毒反應，例如呼吸困難、肺水腫，肌疫李W及中 樞神經系統素亂，表現為頭痛、乏力、抽搖、昏迷或腦水腫。目前發現的微生物來源的有機憐 水解酶包括兩大類：憐酸Ξ醋酶（PTE)，屬于酷胺水解酶超家族；甲基對硫憐水解酶（MPH) 和有機憐水解酶C2 (0PHC2)，屬于β-內酷胺酶超家族。然而，上述有機憐水解酶對常用農 藥馬拉硫憐的降解活性很低。例如，屬于內酷胺酶超家族的有機憐水解酶化0ΡΗ，經過突變 改造后，其雙突變體化〇ΡΗμ2對禁用農藥甲基對硫憐的活力高達56. 8U/mg，但其對目前常用 農藥馬拉硫憐的活力卻不足lU/mg。因此，利用理性的進化分析和蛋白質工程手段，開發具 有高活性、高穩定性的有機憐水解酶突變體，用于降解目前常用的有機憐農藥，進而降低農 作物及±壤的農藥殘留問題，具有較大的實際應用價值。
技術實現思路
為了克服上述已知有機憐水解酶對常用有機憐農藥馬拉硫憐性能欠佳的問題，本 專利技術對已知有機憐水解酶進行基因突變改造w提高有機憐水解酶的活性，同時保留良好的 熱穩定性，進而提供一種工程化有機憐水解酶、其編碼基因，含有該基因的重組表達質粒和 重組表達轉化體及其制備方法，W及突變體蛋白在降解有機憐農藥中的應用技術。 本專利技術的目的可W通過W下技術方案來實現： 本專利技術采取的技術方案之一是： -種工程化有機憐水解酶，所述的工程化有機憐水解酶是如SEQIDNo.1所示氨 基酸序列的有機憐水解酶的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第 262位氨基酸殘基中的一個或者多個位點經過氨基酸替換后形成的新氨基酸序列組成且對 馬拉硫憐水解活性提高的工程化有機憐水解酶。 所述工程化有機憐水解酶的制備可W是從表達該蛋白質的表達轉化體中分離獲 得，也可W是人工合成獲得。由SEQIDNo. 1所示氨基酸序列所構成的有機憐水解酶是申 請人自己保藏的有機憐水解酶突變體，命名為化〇PHm2,并且在申請號為201410167955. 6 的中國專利中有公開。該蛋白質對甲基對硫憐具有很高的有機憐水解酶活性，比活力為 56. 8U/mg，Ts。值為76. 8°C，具有很好的熱穩定性，但其對常用農藥馬拉硫憐的水解活力僅 為 0. 9抓/mg。[000引為了提高化0PHm2蛋白對馬拉硫憐的水解活性，我們通過對化0PHm2進行序列和 構效分析，利用多種蛋白質工程改造技術，組合有益突變，從中篩選對馬拉硫憐水解活性提 高、同時保持酶的高熱穩定性的工程化有機憐水解酶。 其中所述工程化有機憐水解酶較佳的情況是：對SEQIDNo. 1所示氨基酸序列的 第 1、14、55、57、68、83、87、88、114、137、177、187、188、203、248、262、267、318 位氨基酸殘基 中的一個或者多個位點進行氨基酸替換后的形成的新氨基酸序列對應的水解酶。 所述工程化有機憐水解酶更佳的情況是：對SEQIDNo. 1所示氨基酸序列的有機 憐水解酶的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位和第262位氨基酸殘 基中的一個或者多個位點經過氨基酸替換形成的新氨基酸序列對應的水解酶。 所述工程化有機憐水解酶最佳的情況是：同時對SEQIDNo.1所示氨基酸序列的 有機憐水解酶的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位和第262位氨基 酸殘基經過氨基酸替換的新氨基酸序列對應的水解酶。 如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的各位氨基酸殘基的替換具體如下： 所述氨基酸序列的第1位的甲硫氨酸突變為精氨酸（M1R); 所述氨基酸序列的第14位的甲硫氨酸突變為亮氨酸（M14L);所述氨基酸序列中的第55位的鄉氨酸突變為異亮氨酸（V55I)、亮氨酸（V55L)或 絲氨酸（V55巧，其中更佳的是突變為異亮氨酸（V55I);所述氨基酸序列中的第57位的亮氨酸突變為甘氨酸化57G)或異亮氨酸化571)， 其中更佳的是突變為甘氨酸化57G); 所述氨基酸序列的第68位的賴氨酸突變為谷氨酸化68巧； 所述氨基酸序列的第83位的賴氨酸突變為甘氨酸化83G); 所述氨基酸序列的第87位的蘇氨酸突變為丙氨酸（T87A); 所述氨基酸序列的第88位的丙氨酸突變為脯氨酸（A88巧； 所述氨基酸序列的第114位的蘇氨酸突變為丙氨酸燈114A); 所述氨基酸序列的第137位的亮氨酸突變為異亮氨酸化1371); 所述氨基酸序列的第177位的蘇氨酸突變為丙氨酸（T177A); 所述氨基酸序列的第187位的甘氨酸突變為異亮氨酸（G187I); 所述氨基酸序列的第188位的甲硫氨酸突變為苯丙氨酸（M188巧； 所述氨基酸序列的第203位的天冬酷胺突變為天冬氨酸（N203D); 所述氨基酸序列的第248位的異亮氨酸突變為蘇氨酸（I248T);所述氨基酸序列的第262位的鄉氨酸突變為丙氨酸（V262A)或甘氨酸（V262G)，其 中更佳的是突變為丙氨酸（V262A); 所述氨基酸序列的第267位的谷氨酷胺突變為精氨酸（Q274R); 所述氨基酸序列的第318位的絲氨酸突變為甘氨酸（S318G)。 本專利技術采取的技術方案之二是： -種分離的核本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種工程化有機磷水解酶，其特征在于，如SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第262位氨基酸殘基中的一個或者多個位點經過氨基酸替換后形成的新氨基酸序列組成的活性提高的有機磷水解酶突變體。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：許建和，羅曉晶，潘江，
申請(專利權)人：華東理工大學，
類型：發明
國別省市：上海;31