一種單克隆抗體制備方法及其試劑盒技術

本發(fā)明專利技術涉及單克隆抗體制備技術領域，特別涉及一種單克隆抗體制備方法及其試劑盒。該制備方法包括：采用抗原對動物進行免疫，取免疫脾細胞；將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得融合細胞；采用間接ELISA方法對融合細胞進行檢測，獲得陽性雜交瘤細胞；采用競爭抑制ELISA方法對陽性雜交瘤細胞進行檢測，獲得具有競爭反應的雜交瘤細胞；將具有競爭反應的雜交瘤細胞進行亞克隆，獲得單克隆抗體雜交瘤細胞；單克隆抗體雜交瘤細胞分泌獲得單克隆抗體。本發(fā)明專利技術采用酶聯(lián)免疫吸附試驗間接法與競爭法相結(jié)合的方法篩選單克隆抗體，操作簡便，目的性強，工作量小，能在短時間內(nèi)鎖定優(yōu)質(zhì)的雜交瘤細胞株。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術設及單克隆抗體制備
，特別設及一種單克隆抗體制備方法及其試 劑盒。
技術介紹
屯、力衰竭簡稱屯、衰，是指由于屯、臟的收縮功能和或舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜 脈回屯、血量充分排出屯、臟，導致靜脈系統(tǒng)血液渺積，動脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起屯、臟 循環(huán)障礙癥候群，此種障礙癥候群集中表現(xiàn)為肺渺血、腔靜脈渺血。在臨床上，根據(jù)患者有 冠屯、病、高血壓等基礎屯、血管病的病史，有休息或運動時出現(xiàn)呼吸困難、乏力、下肢水腫的 臨床癥狀，有屯、動過速、呼吸急促、肺部羅音、胸腔積液、頸靜脈壓力增高、外周水腫、肝臟腫 大的體征，有屯、腔擴大、第=屯、音、屯、臟雜音、超聲屯、動圖異常、利鋼膚度NP/NT-proBN巧水 平升高等屯、臟結(jié)構或功能異常的客觀證據(jù)，有收縮性屯、力衰竭或舒張性屯、力衰竭的特征， 可作出診斷。N端腦鋼膚前體（NT-BNP)是腦鋼膚前體原（preproBNP)的蛋白酶裂解產(chǎn)物。腦 鋼膚前體原（preproBNPlOS個氨基酸殘基）在轉(zhuǎn)化酶依賴反應中形成兩個多膚，BNP(殘基 77-108)和N端腦鋼膚前體（NT-BNP殘基1-76)。運兩種多膚濃度在不同的屯、臟病患者中 都有升高。屯、衰患者血液中運兩種多膚的濃度與疾病的嚴重程度成正比，而屯、衰患者血漿 NT-BNP濃度可達到幾十個ng/mU是檢測屯、臟病患者的一項重要指標。目前，很多公司化及研發(fā)單位制備的體外診斷用的NT-BNP蛋白單克隆抗體，大多 通過細胞融合到抗體的形成，得到一株可用于臨床診斷的單克隆抗體需要通過大量的篩選 過程，其在細胞篩選中用到的技術方案是通過酶聯(lián)免疫吸附試驗進行大量的篩選，然后得 到陽性細胞株，運種篩選抗體的方式?jīng)]有明確的目的性，且運些細胞株中大量存在假陽性 或者是靈敏度和特異性性不好的情況，然后不得不大量純化逐步檢測W及試驗。因此導致 大量人力物力及科研經(jīng)費的損失，耗時比較長，導致優(yōu)質(zhì)抗體細胞株丟失，未必能篩選到優(yōu) 質(zhì)的抗體。鑒于NT-BNP抗體的制備過程繁瑣、耗時比較長、所產(chǎn)生的單克隆抗體效價低、不 能滿足實驗需求等問題，急需提供一種NT-BNP蛋白單克隆抗體及其它單克隆抗體的快速 準確的制備方法。
技術實現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術提供了一種單克隆抗體制備方法及其試劑盒。該方法采用酶聯(lián) 免疫吸附試驗間接法與競爭法相結(jié)合的方法篩選單克隆抗體，操作簡便，目的性強，工作量 小，能在短時間內(nèi)鎖定優(yōu)質(zhì)的雜交瘤細胞株。為了實現(xiàn)上述專利技術目的，本專利技術提供W下技術方案：本專利技術提供了一種單克隆抗體制備方法，包括如下步驟：采用抗原對動物進行免疫，取免疫脾細胞；將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得融合細胞； 采用間接化ISA方法對融合細胞進行檢測，獲得陽性雜交瘤細胞； 采用競爭抑制化ISA方法對陽性雜交瘤細胞進行檢測，獲得具有競爭反應的雜交 瘤細胞； 將具有競爭反應的雜交瘤細胞進行亞克隆，獲得單克隆抗體雜交瘤細胞；單克隆 抗體雜交瘤細胞分泌獲得單克隆抗體。 本專利技術采用酶聯(lián)免疫吸附試驗間接法與競爭法相結(jié)合的方法篩選單克隆抗體，通 過已知優(yōu)質(zhì)的抗體與預篩選抗體的相互競爭作用，篩選過程中細胞培養(yǎng)上清液與優(yōu)質(zhì)抗體 性質(zhì)不一致顯陽性；而與優(yōu)質(zhì)抗體具有相同位點的抗體，由于相互間存在競爭抗原位點的 關系顯陰性。應用本專利技術方法篩選能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，操作簡便，目的 性強，工作量小，能在短時間內(nèi)鎖定優(yōu)質(zhì)的雜交瘤細胞株。 在本專利技術提供的一些實施例中，直接競爭抑制ELISA方法為：將抗原包被到固相 載體上，封閉，加入陽性雜交瘤細胞產(chǎn)生的培養(yǎng)上清液進行解育，然后加入已知的與抗原對 應的單克隆抗體進行解育，顯色，終止反應，檢測0D值；與抗原對應的單克隆抗體為生物酶 標記的與抗原對應的單克隆抗體。 在本專利技術提供的一些實施例中，間接化ISA方法為：將抗原包被到固相載體上， 封閉，加入融合細胞的培養(yǎng)上清液進行解育，然后加入生物酶標記的第二抗體進行解育，顯 色，終止反應，檢測0D值。 作為優(yōu)選，亞克隆的次數(shù)為2~4次。 在本專利技術提供的一些實施例中，抗原為NT-BNP蛋白，單克隆抗體為NT-BNP單克隆 抗體。 在本專利技術提供的一些實施例中，已知的與抗原對應的單克隆抗體為15C4或 13G12。 在本專利技術提供的另一些實施例中，抗原為降巧素原蛋白，所述單克隆抗體為降巧 素原單克隆抗體。 在本專利技術提供的一些實施例中，已知的與抗原對應的酶標單克隆抗體為酶標27A3 或酶標14A2。 本專利技術還提供了一種NT-BNP蛋白單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟： 采用NT-BNP蛋白對動物進行免疫，取免疫脾細胞； 將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得融合細胞；采用間接化ISA方法對融 合細胞進行檢測，獲得陽性雜交瘤細胞； 采用競爭抑制化ISA方法對陽性雜交瘤細胞進行檢測，獲得具有競爭反應的雜交 瘤細胞；將具有競爭反應的雜交瘤細胞進行亞克隆，獲得NT-BNP蛋白單克隆抗體雜交瘤 細胞；NT-BNP蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞分泌獲得NT-BNP蛋白單克隆抗體。 本專利技術采用酶聯(lián)免疫吸附試驗間接法與競爭法相結(jié)合的方法篩選NT-BNP蛋白單 克隆抗體，通過已知優(yōu)質(zhì)的抗體與預篩選抗體的相互競爭作用，篩選過程中細胞培養(yǎng)上清 液與優(yōu)質(zhì)抗體性質(zhì)不一致顯陽性；而與優(yōu)質(zhì)抗體具有相同位點的抗體，由于相互間存在競 爭抗原位點的關系顯陰性。應用本專利技術方法進行分泌NT-BNP單克隆抗體的雜交瘤細胞的 篩選，操作簡便，目的性強，工作量小，能在短時間內(nèi)鎖定優(yōu)質(zhì)的雜交瘤細胞株。 作為優(yōu)選，競爭抑制化ISA方法為直接競爭抑制化ISA方法。 在本專利技術提供的一些實施例中，競爭抑制化ISA方法為：將NT-BNP抗原包被到固 相載體上，封閉，加入陽性雜交瘤細胞產(chǎn)生的培養(yǎng)上清液解育，然后加入已知的生物酶標記 的NT-BNP蛋白單克隆抗體解育，顯色，終止反應，檢測0D值。 在本專利技術提供的一些實施例中，已知的生物酶標記的NT-BNP蛋白單克隆抗體為 生物酶標記的15C4或13G12。 在本專利技術提供的一些實施例中，間接化ISA方法為：將NT-BNP抗原包被到固相載 體上，封閉，加入融合細胞的培養(yǎng)上清液解育，然后加入生物酶標記的第二抗體解育，顯色， 終止反應，檢測0D值。 作為優(yōu)選，亞克隆的次數(shù)為2~4次。 在本專利技術提供的一些實施例中，亞克隆采用的方法為有限稀釋法。 在本專利技術提供的一些實施例中，NT-BNP蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞分泌獲得 NT-BNP蛋白單克隆抗體為：將NT-BNP蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞接種于動物腹腔，收集腹 水，純化，獲得NT-BNP蛋白單克隆抗體。 本專利技術還提供了一種單克隆抗體制備試劑盒，包括抗原、包被液、封閉液、生物酶 標記的第二抗體、已知的與抗原對應的酶標單克隆抗體、顯色劑和終止液。 在本專利技術提供的一些實施例中，抗原為NT-BNP蛋白；與抗原對應的酶標單克隆抗 體為酶標15C4或酶標13G12。 在本專利技術提供的另一些實施例中，抗原為降巧素原蛋白；與抗原對應的酶標單克 隆抗體為酶標27A3或酶標14A2。 作為優(yōu)選，第二抗體為羊抗鼠IgG。 在本專利技術提供的一些實施例中，包被液為碳酸鹽緩沖液，其pH為9. 6。 在本專利技術提供的一些實施例中，封閉液為1%的BSA。 在本專利技術提供的一本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種單克隆抗體制備方法，其特征在于，包括如下步驟：采用抗原對動物進行免疫，取免疫脾細胞；將所述免疫脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得融合細胞；采用間接ELISA方法對所述融合細胞進行檢測，獲得陽性雜交瘤細胞；采用競爭抑制ELISA方法對所述陽性雜交瘤細胞進行檢測，獲得具有競爭反應的雜交瘤細胞；將所述具有競爭反應的雜交瘤細胞進行亞克隆，獲得單克隆抗體雜交瘤細胞；所述單克隆抗體雜交瘤細胞分泌獲得單克隆抗體。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：劉偉，
申請(專利權)人：三諾生物傳感股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：湖南;43