一種纖維二糖水解酶突變體制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及酶基因工程改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種纖維二糖水解酶突變體，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：3，編碼基因的一種核酸序列為SEQ?ID?NO：4。本發(fā)明專利技術(shù)提供的纖維二糖水解酶突變體比野生型的耐酸性更強(qiáng)，其最適pH為5.0，且在pH3.5-7.0范圍內(nèi)均能保持65％以上的酶活水平，而野生型的最適pH為5.5。所述纖維二糖水解酶突變體可廣泛應(yīng)用于木質(zhì)纖維素的降解，能顯著提高木質(zhì)纖維素的糖化率。其中，添加本發(fā)明專利技術(shù)所述纖維二糖水解酶突變體MAF6A的實(shí)驗(yàn)組2中木質(zhì)纖維素的糖化率比對(duì)照組提高了6.5％，比添加野生型纖維二糖水解酶AF6A的實(shí)驗(yàn)組1提高了3.5％，取得了意料不到的技術(shù)效果。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種纖維二糖水解酶突變體
本專利技術(shù)屬于酶工程
，具體涉及一種纖維二糖水解酶突變體及其在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
纖維素酶(Cellulases)是水解纖維素(β-1，4葡聚糖或者β-D-糖苷鍵)導(dǎo)致形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖(cellooligosaccharides)和類似物質(zhì)的酶。纖維素酶在傳統(tǒng)上已被分為三個(gè)主要類型：內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases，EC3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(exoglucanases)或者纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosideglucohydrolase，EC3.2.1.21)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的非晶體部分，而外切葡聚糖酶纖維二糖水解酶是唯一可以作用于晶體纖維素的酶組分。因此，纖維二糖水解酶在纖維素酶體系中的存在對(duì)于晶體纖維素的有效溶解是必需的。纖維二糖水解酶由3個(gè)部分組成：具有催化活性的催化結(jié)構(gòu)域，作用為錨定纖維素的纖維素結(jié)合域以及連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的一段短肽。在水解纖維素過程中，纖維二糖水解酶主要作用于纖維素線性分子非還原端，水解β-1,4-糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，使結(jié)晶纖維素成為易溶解的非結(jié)晶纖維素。當(dāng)前經(jīng)濟(jì)過分依賴于石油、煤炭等化石燃料，其不可再生性導(dǎo)致資源逐漸枯竭，燃燒產(chǎn)生的二氧化碳已造成氣候環(huán)境的日益惡化。尋找可再生的清潔能源成為各國科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。其中生物質(zhì)能源因具有來源廣泛、價(jià)格低廉、再生性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為最具潛力的能源物質(zhì)。生物乙醇是源于可再生物質(zhì)的重要能源之一。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的植物約10000億噸，為避免與人爭(zhēng)糧，木質(zhì)纖維素將成為生物乙醇生產(chǎn)最具潛力的原料。木質(zhì)纖維素?zé)捴粕镆掖歼^程通常包括預(yù)處理、水解、發(fā)酵、蒸餾等單元操作，其中纖維素水解為可發(fā)酵糖是纖維素乙醇煉制過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。目前，木質(zhì)纖維素的降解主要有化學(xué)法和酶法水解。與化學(xué)法水解相比，酶法水解工藝條件溫和，設(shè)備簡(jiǎn)單，能耗低，同時(shí)具有副產(chǎn)物少、環(huán)境友好等特點(diǎn)，受到廣泛重視并取得重大進(jìn)展。由于木質(zhì)纖維素中的纖維素主要以結(jié)晶狀態(tài)存在，因此纖維二糖水解酶在木質(zhì)纖維素水解中的作用相當(dāng)重要。但目前現(xiàn)有的纖維二糖水解酶活力低，耗酶量大，發(fā)酵成本高，且其在酸性條件下的酶解效率和轉(zhuǎn)化率普遍偏低，嚴(yán)重限制了木質(zhì)纖維素在生物乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種纖維二糖水解酶突變體及其在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用。本專利技術(shù)通過對(duì)纖維二糖水解酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，獲得了突變體蛋白。所述突變體在酸性條件下的酶活力得到顯著提高，且耐熱性更強(qiáng)，能大大提高木質(zhì)纖維素的降解效率，進(jìn)而促進(jìn)其在生物乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。本專利技術(shù)一方面提供了一種纖維二糖水解酶突變體，是氨基酸序列為SEQIDNO：1的纖維二糖水解酶第33位氨基酸由Gln變?yōu)長(zhǎng)ys，第91位氨基酸由Ala變?yōu)長(zhǎng)ys，第105位氨基酸由Glu變?yōu)锳la，第112位氨基酸由Ala變?yōu)門hr，第224位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn。上述纖維二糖水解酶突變體的氨基酸序列為SEQIDNO：3，其編碼基因的核酸序列為SEQIDNO：4。本專利技術(shù)另一方面提供了一種重組質(zhì)粒，其攜帶有編碼序列為SEQIDNO：4的纖維二糖水解酶突變體的基因。本專利技術(shù)還提供了一種重組菌株，是通過將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入里氏木霉(Trichodermareesei)中獲得的。本專利技術(shù)還提供了上述纖維二糖水解酶突變體在生物乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。本專利技術(shù)提供的纖維二糖水解酶突變體比野生型的耐酸性更強(qiáng)，其最適pH為5.0，且在pH4.0-7.0范圍內(nèi)均能保持65％以上的酶活水平，而野生型的最適pH為5.5。所述纖維二糖水解酶突變體可廣泛應(yīng)用于木質(zhì)纖維素的降解，能顯著提高木質(zhì)纖維素的糖化率。其中，添加本專利技術(shù)所述纖維二糖水解酶突變體MAF7A的實(shí)驗(yàn)組2中木質(zhì)纖維素的糖化率比對(duì)照組提高了9.5％，比添加野生型纖維二糖水解酶AF7A的實(shí)驗(yàn)組1提高了3.5％，取得了意料不到的技術(shù)效果。附圖說明圖1為重組菌株發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析圖，其中，泳道1為里氏木霉工程菌AF7A發(fā)酵上清液，泳道2為里氏木霉工程菌MAF7A發(fā)酵上清液，泳道3為對(duì)照組宿主菌里氏木霉SCHD4發(fā)酵上清液，泳道1和2中箭頭所指70kDa處的蛋白條帶分別為重組表達(dá)的纖維二糖水解酶AF7A和突變體MAF7A；圖2為纖維二糖水解酶突變體與野生型pH-相對(duì)酶活曲線圖。具體實(shí)施方式本專利技術(shù)用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是本專利技術(shù)不限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑。下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例1：纖維二糖水解酶突變體基因的篩選為了提高野生型纖維二糖水解酶AF7A(氨基酸序列為SEQIDNO:1，編碼核苷酸序列為SEQIDNO：2，由上海生工生物工程股份有限公司合成)在酸性條件下的酶活力，通過定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)該酶進(jìn)行了大量突變的篩選，設(shè)計(jì)PCR引物AF7A-F1、AF7A-R1如下：AF7A-F1：GGCGAATTCATGATGCTGGCCTCCACCTTCTCC(下劃線為限制性內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn))；AF7A-R1：ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGAGAGTAATAATC(下劃線為限制性內(nèi)切酶NotI識(shí)別位點(diǎn))；以野生型纖維二糖水解酶AF7A基因SEQIDNO:2為模板，利用上述引物用GeneMorphII隨機(jī)突變PCR試劑盒(Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，EcoRI、NotI進(jìn)行酶切處理后與經(jīng)同樣酶切后的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，用牙簽逐個(gè)挑至96孔板，每個(gè)孔中加入150μL含有0.1mMIPTG的LB+Amp培養(yǎng)基，37℃，220rpm培養(yǎng)6h左右，離心棄上清，菌體用緩沖液重懸，反復(fù)凍融破壁，獲得含有纖維二糖水解酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。各取50μL裂解液至兩塊新的96孔板，分別在pH6.0和pH4.0的條件下測(cè)定其纖維二糖水解酶酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有些突變子在酸性條件的酶活沒有變化，有些突變子的酶活甚至降低了，對(duì)在pH4.0條件下依然保持高酶活的突變子進(jìn)行DNA測(cè)序，最終，申請(qǐng)人獲得了能顯著提高纖維二糖水解酶酸性耐受性的突變位點(diǎn)組合Q33K、A91K、E105A、A112T和D224N。將含Q33K、A91K、E105A、A112T和D224N突變位點(diǎn)的纖維二糖水解酶突變體命名為MAF7A，其氨基酸序列為SEQIDNO：3，編碼核苷酸序列為SEQIDNO：4。SEQIDNO：4由上海生工生物工程股份有限公司合成，并且在合成序列5’和3’兩端分別加上KpnI和XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。將合成后的基因片段用限制性內(nèi)切酶本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種纖維二糖水解酶突變體，其特征在于，所述的突變體是氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的纖維二糖水解酶第33位氨基酸由Gln變?yōu)長(zhǎng)ys，第91位氨基酸由Ala變?yōu)長(zhǎng)ys，第105位氨基酸由Glu變?yōu)锳la，第112位氨基酸由Ala變?yōu)門hr，第224位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種纖維二糖水解酶突變體，其特征在于，所述的突變體是氨基酸序列為SEQIDNO：1的纖維二糖水解酶第33位氨基酸由Gln變?yōu)長(zhǎng)ys，第91位氨基酸由Ala變?yōu)長(zhǎng)ys，第105位氨基酸由Glu變?yōu)锳la，第112位氨基酸由Ala變?yōu)門hr，第224位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn。2.一種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的突變體。3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李賓，張青，李瑞，王華明，黃亦鈞，許麗紅，許韋，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37