細胞膜穿透肽hPP5及其用途制造技術

本發明專利技術屬于生物醫學領域，涉及一種人源性細胞膜穿透肽hPP5及其用途。本發明專利技術所提供的細胞膜穿透肽hPP5具有穿透細胞膜的功能，可攜帶蛋白質等大分子跨膜進入多種細胞內；且由于該肽段來源于人類蛋白，引起人體免疫反應的可能性小，潛在的不安全因素相對少，因此hPP5是一種極具開發前景的可用于蛋白、多肽等生物活性分子的跨膜運輸載體，可用作細胞內藥物運輸載體。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物醫學領域，具體講，涉及一種細胞膜穿透肽及其用途。
技術介紹
隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質組學的興起，人們發現越來越多的生物分子 比如蛋白質、多肽、核酸等均有可能成為治療藥物。但是與傳統藥物不同的是，這些治療分 子在體內穩定性低，需要在胞內發揮功能的分子難以進入細胞，因而會限制其作為藥物的 推廣應用。故開發能有效攜帶這些治療性生物大分子進入靶細胞，且經濟、安全的載體系統 是亟需解決的問題。 近年來，非病毒藥物運輸載體以其安全性、低毒性、低免疫反應等優點被寄予厚 望。迄今比較常用的生物大分子細胞內導入方式有電穿孔、脂質體轉染和有機高分子納米 顆粒等。但可能存在著安全隱患如對細胞的毒性作用、胞內釋放困難、難于組裝及操作、難 于應用到個體等這樣或那樣的缺點。因此尋找新型的、理想的非病毒藥物輸送系統引起了 學者們的廣泛興趣（圖1)。 在過去的20多年間，將核酸、多肽、蛋白等具有治療作用的生物活性大分子跨膜 轉運至細胞內技術的基礎研究取得了突破性進展。國內外學者在對一些病毒感染特性的研 究中相繼發現了一類蛋白結構域，如：HIV-lTat(48~60)、VP22 (267~300)以及果蠅蛋白 ANTP(43~58)等具有介導異源蛋白、寡聚核酸、金屬螯合物等生物活性大分子直接跨過細 胞膜進入胞漿和核內的功能，這一類富含陽離子、具有穿膜功能的短肽被稱之為細胞膜穿 透肽（cell-penetratingpeptides，CPP)、穿膜肽或蛋白車專導域（proteintransduction domains，PTDs)。1988年Green和Frankel等首次發現TAT--人免疫缺陷病毒（HIV) 的轉錄調節蛋白可以穿透細胞膜/核膜進入細胞漿/細胞核，隨后的研究發現，該蛋白 第48-60位氨基酸殘基（YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全發揮其穿膜功能。以后又相 繼發現了多個源自病毒或其它生物的CPP，如I型單純皰疹病毒（herpessimplexvirus type1，HSV_1)蛋白的VP22、果繩同源觸角蛋白（drosophilahemeoproteinantennapedia transcriptionprotein,ANTP)、乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV)的前S抗原等。 依據其來源不同可將已經發現的CPP大致分為兩類：一類為來源于病毒的短肽，如上面提 及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原等；另一類為根據天然CPP的特點人工合成的短肽，如多聚 精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各種基于不同信號序列合成的肽段等。CPP能在 體外或體內作為載藥多肽，介導一系列生物活性分子如DNA、siRNA、多肽、蛋白質甚至納米 顆粒等進入細胞，發揮各自的生物學效應。這些CPP因其本身具有低毒、副作用小、不干擾 所攜帶大分子生物活性等特點，被廣泛用于體外或/和體內向細胞內運送生物活性分子， 尤其是在抗腫瘤治療的應用研究方面更是引人注目。CPP研究在基礎生物學和應用研究上 都具有極大意義，作為一種有效的胞內運載工具，有著廣泛的應用前景（圖2)。 然而來源于病毒或其他種屬生物蛋白結構域的CPP，在臨床應用上可能仍然存在 一定的安全隱患，比如可能的細胞毒性和免疫原性問題。人們對TAT作為CPP進行了大量 研究，腹腔注射Tat-0 -半乳糖苷酶，能進入小鼠各種臟器組織，甚至可以透過血腦屏障進 入腦組織。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全憂患，一直未能用于臨床研究。另 有報道稱，應用TAT攜帶藥物的上呼吸道噴霧引發了嚴重的肺部病理反應。可見，針對不同 治療需要，開發更為安全的、新型細胞膜穿透肽一一人源性細胞膜穿透肽（hCPP)是非常必 要的。 2002年，Beck-SickingerAG小組開創性地發現了第一個人源性細胞膜穿透 肽一一來源于人降血鈣素（hCT)的第9-32的殘基。隨后相繼報道的人源性細胞膜穿透肽還 有來自于hCLOCK蛋白（一種與生物節律調節有關的蛋白，2004年）、Hph-l( -種人源轉錄 因子，2006年）、Bag-l蛋白（一種可與Bcl-2相互作用的激活糖皮質激素受體的蛋白，2006 年）、pl4ARF蛋白（一種人抑癌基因蛋白，2008年）、人乳鐵蛋白（2009年）、人Cytc77-101 及Cytc86-101 (2010年）和TCTP蛋白（來源于人翻譯控制腫瘤蛋白氨基末端10個氨基酸 殘基，2011年）的CPP等。與其它物種蛋白來源的CPP相比，人源性CPP引起人體的免疫反 應的可能性小，潛在的不安全因素相對少，作為人類疾病治療的藥物載體，具有絕對優勢， 有著更廣闊的開發、應用前景。FutakiS等發現細胞膜穿透肽的穿膜能力與多肽序列中精氨酸殘基的數量和位 置有很大的相關性。我們在從事細胞膜穿透肽研究中，通過對蛋白數據庫中一級結構的檢 索、分析發現人源性的組蛋白去甲基化酶PHD鋅指蛋白13(PHDfingerprotein13)的一 段長為20個氨基酸的短肽的一級結構富含屬于堿性氨基酸的精氨酸和賴氨酸，分布著很 強的正電荷，這與大多數已知CPP的結構特點很相似，繼而分析其二級結構，發現它可形成 經典的a-螺旋構象。推測這段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性細胞膜穿透 肽。我們繼而合成了這段短肽并命名為hPP5,觀察了其對培養細胞的穿膜效率，細胞毒性及 穿膜機制，同時還觀察、評估了其向細胞內遞送綠色熒光蛋白（GFP)的效果，為hPP5作為一 種新型人源性藥物運輸載體的開發提供了科學依據。
技術實現思路
在本專利技術中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗 室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本專利技術，下面提供 相關術語的定義和解釋。 如本文中所使用的，術語"生物分子"是指，存在于生物體中的分子的總稱，包括但 不限于，核酸、寡肽、多肽、蛋白質、糖類、脂質、和小分子化合物以及其任意的復合物。 術語"寡肽"通常是指2-10個氨基酸組成的肽。術語"多肽"通常是指11個以上 的氨基酸組成的肽。術語"蛋白質"通常是指含有51個以上的氨基酸殘基的多肽鏈。 本專利技術的目的是提供一種新的細胞膜穿透肽hPP5,本專利技術提供的細胞膜穿透肽hPP5是源于人類組蛋白去甲基化酶PHD鋅指蛋白13的一段多肽序列，其具有細胞膜穿透能 力，所述多肽序列的長度在20個氨基酸以內，所述的細胞優選真核細胞，更優選動物細胞， 最優選哺乳動物細胞，例如腫瘤細胞。 本專利技術所述細胞膜穿透肽hPP5的多肽序列包含SEQIDN0 :1所示的序列，即Phe-Leu-Leu-Asp-Arg-Lys-Lys-Thr-Asp-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Arg -Arg(SEQIDNO:1)(苯丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-賴氨酸-賴氨 酸-蘇氨酸-天門冬氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-賴氨酸-賴氨酸-賴氨 酸-精氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸），優選地，所述細胞膜穿透肽h本文檔來自技高網...

【技術保護點】
細胞膜穿透肽hPP5，其特征在于該細胞膜穿透肽hPP5是源于人類組蛋白去甲基化酶PHD鋅指蛋白?13的一段多肽序列，其具有細胞膜穿透能力，所述多肽序列的長度在二十個氨基酸以內；優選地，所述細胞膜穿透肽hPP5包含SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列；優選地，所述細胞膜穿透肽hPP5的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；優選地，所述的細胞膜穿透肽hPP5為合成的或重組的。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：柳長柏，王琥，鄒黎黎，馬節蘭，楊英桂，
申請(專利權)人：三峽大學，
類型：發明
國別省市：湖北;42