本發(fā)明專利技術(shù)提供一種基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法。所述的方法首先將特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物吸至離心管中，加入Buffer?A，震蕩、室溫放置5min，在磁力架上進(jìn)行磁珠分離；待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)吸去液體；往含有磁珠的離心管中加入Buffer?B,靜止8min，在磁力架上進(jìn)行磁珠分離；待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)吸去液體，保留磁珠；加入Buffer?C，在磁力架上進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)吸取溶液，即為回收后的PCR產(chǎn)物。使用磁珠法來(lái)純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，整個(gè)流程方便快捷，與常規(guī)純化方法相比，本方法顯得更加方便、快捷，不需要使用到離心機(jī)等設(shè)備。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，屬于生物
技術(shù)背景PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸:DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2?4分鐘，2?3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。通過(guò)PCR獲得的目的基因需要進(jìn)一步純化，這是因?yàn)镻CR反應(yīng)體系中含有dNTP、Mg2+、DNA聚合酶等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)下游的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，因此需要對(duì)獲得的特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的純化，目前常用的特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的回收方法基本上都是吸附柱回收法。利用磁珠法來(lái)純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法目前未見(jiàn)報(bào)道。磁珠法純化DNA主要是利用利息交換吸附材料吸附核酸，從而將核酸和其他雜質(zhì)分離。使用磁珠法來(lái)純化純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的最大優(yōu)點(diǎn)就是自動(dòng)化。磁珠在磁場(chǎng)條件下可以發(fā)生聚集或分散，整個(gè)流程方便快捷，不需要使用到離心機(jī)等設(shè)備。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
: 基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，使用磁珠法純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的最大優(yōu)點(diǎn)就是自動(dòng)化。磁珠在磁場(chǎng)條件下可以發(fā)生聚集或分散，整個(gè)流程方便快捷，不需要使用到離心機(jī)等設(shè)備。基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，主要包括利用磁珠法快速純化PCR產(chǎn)物。磁珠法快速純化PCR產(chǎn)物:將特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物吸至1.5ml離心管，加入等體積的Buffer A0震蕩10s。室溫放置5min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。經(jīng)觀察，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入ImlBufferB,打勻后室溫靜止8min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。經(jīng)觀察，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入50 μ I Buffer C，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。經(jīng)觀察，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)吸取溶液，此溶液即為回收后的PCR產(chǎn)物。于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。磁珠為硅基生物磁珠，粒徑為lum。Buffer A溶液的配置:異丙醇:磁珠混懸液的體積比為24:1，其中磁珠混懸液由磁珠和水按照1:2體積比配置。Buffer B 溶液的配置:24.3-21.4 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)，2.1-4.2mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，42.9-85.7 mmol /T, Nacl，60-80% 無(wú)水乙醇。Buffer C 溶液的配置:8-10mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)，ΡΗ=8.0-9.0。采用本方法能簡(jiǎn)單、快速地純化特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。與以往的特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化方法相比，本方法不需要使用離心機(jī)等大型儀器。便于小實(shí)驗(yàn)室更好地開(kāi)展分子生物學(xué)的相關(guān)研究。本專利技術(shù)的顯著優(yōu)點(diǎn): 基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，使用磁珠法來(lái)純化純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的最大優(yōu)點(diǎn)就是自動(dòng)化。磁珠在磁場(chǎng)條件下可以發(fā)生聚集或分散，整個(gè)流程方便快捷，不需要使用到離心機(jī)等設(shè)備。【附圖說(shuō)明】圖1為大腸桿菌16s rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果。圖2為16s rDNA基因純化后的檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施例圖1中，泳道1，2，3，4是大腸桿菌16s rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果，泳道5是TAKARA公司的 DL2000 DNA marker0圖2中，泳道1，2是利用磁珠法快速純化16s rDNA基因PCR產(chǎn)物后的檢測(cè)結(jié)果圖，泳道 3 是 TAKARA 公司的 DL2000 DNA marker。本專利技術(shù)提供一種基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，該方法能通過(guò)磁珠吸附特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，利用該方法能夠在不使用離心機(jī)等大型儀器設(shè)備的條件下快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。具體步驟如下: 磁珠法快速純化PCR產(chǎn)物:將4管50ul的16s rDNA基因PCR產(chǎn)物分成2組，每組2管混合加到1.5ml離心管，各加入10ul的Buffer A0震蕩1s0室溫放置5min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。經(jīng)觀察，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入ImlBuffer B,打勻后室溫靜止8min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。經(jīng)觀察，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠。往含有磁珠的離心管中加入50 μ I Buffer C，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離。經(jīng)觀察，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)吸取溶液，此溶液即為回收后的PCR產(chǎn)物。于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。磁珠為硅基生物磁珠，粒徑為Ium0Buffer A異丙醇:磁珠混懸液的體積比為24:1，其中磁珠混懸液由磁珠和水按照1:2體積比配置。Buffer B溶液的配置:28.6mmol/L三輕甲基氨基甲燒(Tris), 3.4mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA) , BOmmoI /T, Nacl, 70% 無(wú)水乙醇。Buffer C溶液的配置:8mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)，PH=8.0。大腸桿菌16s rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，泳道1，2，3，4是大腸桿菌16s rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果，泳道5是DNA marker ο 16s rDNA基因純化后的檢測(cè)結(jié)果圖見(jiàn)圖2，泳道1，2是利用磁珠法快速純化16s rDNA基因PCR產(chǎn)物后的檢測(cè)結(jié)果圖，泳道3是DNA marker。從圖中可看出本方法可以快速對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。【主權(quán)項(xiàng)】1.一種基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，主要包括利用磁珠法快速純化PCR產(chǎn)物，其特征在于：將特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物吸至I. 5ml離心管，加入等體積的Buffer A，震蕩10s，室溫放置5min ;將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的離心管中加入ImlBuffer B,打勻后室溫靜止8min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的離心管中加入50 μ I Buffer C，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)吸取溶液，此溶液即為回收后的PCR產(chǎn)物，最后于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，其特征在于所述的磁珠為硅基生物磁珠，粒徑為lum。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，其特征在于所述的Buffer A溶液的配置為異丙醇：磁珠混懸液的體積比為2本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基于磁珠法快速純化特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，主要包括利用磁珠法快速純化PCR產(chǎn)物，其特征在于：將特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物吸至1.5ml離心管，加入等體積的?Buffer?A，震蕩10s，室溫放置5min；將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的離心管中加入1mlBuffer?B,打勻后室溫靜止8min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠，往含有磁珠的離心管中加入50μl?Buffer?C,將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)吸取溶液，此溶液即為回收后的PCR產(chǎn)物，最后于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王清水，余彥，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：福建師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：福建;35
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