治療劑的遞送制造技術(shù)

產(chǎn)生包含針對(duì)致癌基因或原癌基因或其基因產(chǎn)物的寡核苷酸抑制劑的納米囊泡的方法，所述方法包括a)將編碼能夠抑制人致癌基因性或原癌基因性轉(zhuǎn)錄因子(oncogenic?or?proto-oncogenic?transcription?factor)的寡核苷酸的DNA序列引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)允許細(xì)胞表達(dá)所述抑制劑寡核苷酸；以及c)從所述細(xì)胞獲得包含所述抑制劑寡核苷酸的納米囊泡。由要求保護(hù)的方法產(chǎn)生的納米囊泡可有效并特異地靶向例如癌細(xì)胞以遞送抑制劑寡核苷酸。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】【專利說(shuō)明】治療劑的遞送 專利
本專利技術(shù)涉及通過(guò)細(xì)胞來(lái)源的囊泡遞送潛在的治療劑。 專利技術(shù)背景 癌癥是全世界死亡的主要原因。2008年，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WH0)，各種癌 癥導(dǎo)致了 760萬(wàn)例死亡（約所有死亡例的13% )，并且這個(gè)數(shù)字預(yù)計(jì)將繼續(xù)上升， 估計(jì)在 2030 年全世界有 1310 萬(wàn)死亡例。 惡性黑色素瘤是由皮膚腫瘤引起的大多數(shù)死亡的原因，并且是年輕人中最常見(jiàn) 的惡性腫瘤。當(dāng)黑色素瘤是轉(zhuǎn)移性的時(shí)，預(yù)后不利，且治療可選方案很少。葡萄膜黑色素 瘤具有不同于皮膚黑色素瘤的臨床特征，并經(jīng)常主要傳播至肝。對(duì)于葡萄膜黑色素瘤，已 指出大約一半的患者在眼部原發(fā)性腫瘤治療后的15年內(nèi)將發(fā)展轉(zhuǎn)移病灶。肝轉(zhuǎn)移診斷 后的平均存活時(shí)間為8至10個(gè)月，且具有葡萄膜黑色素瘤的肝轉(zhuǎn)移的患者的死亡率在 兩年中是92%。一種治療選擇是對(duì)肝部局部灌注過(guò)高溫度（hyperthermia)和溶肉瘤素 (melphalan)。然而，這種方法極具侵入性并與手術(shù)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。盡管在大多數(shù)病例 中觀察到緩解，但是存活期僅稍許延長(zhǎng)。 皮膚的黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤僅僅是每年奪走數(shù)百萬(wàn)人的生命的癌癥的兩 個(gè)實(shí)例。因此，癌癥治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面對(duì)的主要挑戰(zhàn)之一。 總體上，目前的抗癌治療策略包括外科手術(shù)、放射治療、細(xì)胞毒性藥物（化療）和 激素藥物。化療劑的缺點(diǎn)是，它們是非選擇性的并引起不良的副作用，該不良的副作用有效 地限制劑量并因此還限制治療效果。存在對(duì)改進(jìn)的、更有選擇性的癌癥療法的需要。 直接革E1向點(diǎn)突變致癌基因的藥物的罕見(jiàn)實(shí)例是維羅非尼（vemurafenib)，其特 異性地靶向皮膚黑素瘤中常見(jiàn)的BRAFV6°°E突變，與化療相比具有相對(duì)較少的脫靶效應(yīng) (off-targeteffect)。然而，這種治療在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中僅使壽命延長(zhǎng)幾個(gè)月，且僅在 具有該特定突變的那些黑色素瘤中有效。因此，一種可能性將是，靶向下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分 子。然而，下游靶標(biāo)缺乏酶活性，并且由于其三級(jí)結(jié)構(gòu)，常常不可能用小分子治療。另外，由 于小分子抑制劑會(huì)遍及全身分布，其也會(huì)在依賴這些下游分子的正常的健康細(xì)胞中引起全 身性副作用。 在過(guò)去十年中，基因治療已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注，并認(rèn)為在未來(lái)，基因治療可應(yīng) 用于許多疾病，包括癌癥。 基因治療的最常見(jiàn)形式涉及使用編碼功能性、治療性基因的DNA來(lái)代替突變基 因。其他類型的基因治療涉及直接校正突變，或使用編碼治療性蛋白藥物的DNA(而不是天 然的人類基因）來(lái)提供治療。還已提出，稱為RNAi的RNA干擾對(duì)于開(kāi)發(fā)針對(duì)例如，傳染病 或癌癥的基因治療可能是合適的。 自20世紀(jì)90年代末，已經(jīng)知曉，RNAi是發(fā)生在許多真核細(xì)胞中的基因調(diào)控機(jī)制， 且已被用作實(shí)現(xiàn)基因敲除的主要研究工具。 然而，發(fā)展基于RNAi的療法和其他基因治療應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)是，治療劑（例如， RNA分子）的遞送。病毒載體可能是有效的，但是可能產(chǎn)生安全隱患，并且可被患者的免疫 系統(tǒng)快速消除，降低其作用。 當(dāng)靶標(biāo)是對(duì)正常的健康細(xì)胞的功能也重要的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，遞送方式是特別 重要的。因此，將藥物以集中的方式遞送至患病細(xì)胞特別地具有降低全身性副作用及其他 細(xì)胞中的副作用的潛力。 因此，成功靶向參與疾病，包括癌癥的基因及蛋白的一個(gè)障礙是開(kāi)發(fā)安全且有效 的將治療劑遞送至靶標(biāo)的方法。 專利技術(shù)概沐 本專利技術(shù)的目的是至少部分地克服現(xiàn)存技術(shù)的缺點(diǎn)，并提供將治療劑，特別是寡核 苷酸遞送至靶細(xì)胞的手段。 在第一方面，這些目的及其他目的通過(guò)產(chǎn)生包含針對(duì)致癌基因或原癌基因或其基 因產(chǎn)物的抑制劑寡核苷酸的納米囊泡的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述方法包括a)將編碼能夠抑制人致癌基因或原癌基因或其基因產(chǎn)物的核酸的DNA序列引入 哺乳動(dòng)物細(xì)胞； b)在允許表達(dá)所述寡核苷酸抑制劑的條件下維持細(xì)胞；以及 c)從所述細(xì)胞獲得包含所述寡核苷酸抑制劑的納米囊泡。 獲得納米囊泡的步驟可包括從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離天然釋放的細(xì)胞外囊泡，和/或 通過(guò)微米過(guò)濾器和/或納米過(guò)濾器擠壓細(xì)胞產(chǎn)生納米囊泡。 如本文所用，"致癌基因"是指具有導(dǎo)致癌癥的潛力的基因。在癌細(xì)胞中，致癌基因 經(jīng)常突變或以高水平表達(dá)（上調(diào)或擴(kuò)增）。"原癌基因"是指，由于突變或增加的表達(dá)可變 成致癌基因的基因。已知的原癌基因的實(shí)例包括狀3、1犯\1^(：、￡服和了服。 如本文所用，"納米囊泡"是指具有在納米范圍內(nèi)并且通常小于500nm的尺寸的細(xì) 胞來(lái)源的囊泡。"細(xì)胞來(lái)源的囊泡"包括細(xì)胞天然釋放的細(xì)胞外囊泡或外來(lái)體，以及通過(guò)微 米過(guò)濾器和/或納米過(guò)濾器連續(xù)擠壓細(xì)胞而從細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡。通過(guò)連續(xù)擠壓從細(xì)胞產(chǎn)生 的納米囊泡可稱為"人工納米囊泡"，然而應(yīng)注意，在該背景下"人工"僅意指并非由細(xì)胞天 然釋放的納米囊泡（相對(duì)于例如，外來(lái)體而言）。因此，在該背景下"人工"并不暗示著納米 囊泡是合成的；它們?nèi)耘f是細(xì)胞來(lái)源的并由與納米囊泡所源自的細(xì)胞（"生產(chǎn)細(xì)胞"）相同 的組分構(gòu)成。 如本文所用，"抑制"意指例如，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄、mRNA降解、或抑制mRNA翻譯為蛋 白，減少產(chǎn)生功能性基因產(chǎn)物（例如蛋白）的基因的表達(dá)。在本專利技術(shù)的上下文中，"抑制"不 必是完全的；部分抑制或阻抑或下調(diào)也可提供期望的作用。 如本文所用，"寡核苷酸抑制劑"是指為抑制劑，S卩，能夠抑制靶分子的寡核苷酸。 它還可稱為"寡核苷酸抑制劑"。 因?yàn)榧{米囊泡的產(chǎn)生可容易地通過(guò)培養(yǎng)更多的生產(chǎn)納米囊泡的細(xì)胞按比例放大， 且納米囊泡可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)大量地產(chǎn)生，例如當(dāng)細(xì)胞正在表達(dá)最佳水平的靶分子時(shí)， 所以本專利技術(shù)的方法是有利的，特別是與使用合成遞送媒介物，諸如合成脂質(zhì)體相比。另外， 本專利技術(shù)獲得的納米囊泡，特別是通過(guò)連續(xù)擠壓生產(chǎn)細(xì)胞獲得的納米囊泡，可包含較高濃度 的抑制劑寡核苷酸（較高的負(fù)載能力），并可更容易地負(fù)載抑制劑寡核苷酸，諸如siRNA。此 外，納米囊泡的各種修飾，例如通過(guò)在表面上表達(dá)革G向分子的修飾，成為可能或至少被極大 地簡(jiǎn)化。本專利技術(shù)的方法還具有成本效益，因?yàn)楫a(chǎn)生納米囊泡的細(xì)胞的培養(yǎng)物可通過(guò)正常的 細(xì)胞培養(yǎng)按比例放大，并且還可被冷凍，這減少了與細(xì)胞的貯藏壽命（shelf-life)相關(guān)的 浪費(fèi)。 在本專利技術(shù)的實(shí)施方案中，抑制劑寡核苷酸是人致癌基因性或原癌基因性轉(zhuǎn)錄因子 (oncogenicorproto-oncogenictranscriptionfactors)的抑制劑。通過(guò)革巴向車專錄因 子，許多不同的惡性腫瘤可被一種抑制劑來(lái)抑制。優(yōu)選地，抑制劑寡核苷酸可以是人MYC基 因或基因產(chǎn)物，優(yōu)選地c-Myc基因或基因產(chǎn)物的抑制劑，或E2F基因家族成員或其基因產(chǎn)物 的抑制劑。在其他實(shí)施方案中，抑制劑寡核苷酸可以是缺乏酶活性的人細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子， 例如Ras家族成員的抑制劑。 在本專利技術(shù)的實(shí)施方案中，寡核苷酸可以是RNA，優(yōu)選RNAi分子。RNAi分子可選自 由以下組成的組：shRNA、siRNA、miRNA、piRNA、nasiRNA或反義RNA，或具有RNAi能力的任 何其他分子。 在本專利技術(shù)的實(shí)施方案中，編碼能夠抑制人致癌基因或原癌基因的寡核苷酸的DNA 序列可以是選自由以下組成的組的DNA序列：SEQ ID N0:l-92和SEQ ID N0:185-218,優(yōu)選 地選自由以下組成的組：3￡〇10勵(lì)：1-32、5￡〇10勵(lì):本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種產(chǎn)生納米囊泡的方法，所述納米囊泡包含針對(duì)致癌基因或原癌基因或其基因產(chǎn)物的抑制劑寡核苷酸，所述方法包括a)將編碼能夠抑制人致癌基因性或原癌基因性轉(zhuǎn)錄因子的寡核苷酸的DNA序列引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)在允許所述細(xì)胞表達(dá)所述抑制劑寡核苷酸的條件下維持所述細(xì)胞；以及c)從所述細(xì)胞獲得包含所述抑制劑寡核苷酸的納米囊泡。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：揚(yáng)·洛特瓦爾，喬納斯·安德烈·尼爾松，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：揚(yáng)·洛特溫爾，喬納斯·安德烈·尼爾松，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：瑞典;SE