一種快速鑒定產生長素的植物內生細菌的方法技術

本發明專利技術屬于微生物技術領域，涉及一種快速鑒定產生長素的植物內生細菌的方法；包括以下步驟：（1）培養基及顯色液的配制：所用的培養基為含色氨酸濃度0.5-2g/L的改良的R2A分離鑒定培養基，生長素顯色液為2mL的0.5M氯化鐵溶液以及98mL的體積分數為25~35%的高氯酸混勻；（2）植物組織的預處理：用體積分數為70~75%的乙醇和5~8%的次氯酸鈉溶液分別浸泡后，用蒸餾水沖洗；（3）產生長素內生細菌的鑒定；本發明專利技術將分離培養基與產生長素鑒定培養基改良整合，在培養基中添加生產生長素的前體色氨酸，在分離菌株后立即施用生長素顯色液，在5~10min內快速辨別出產生長素的內生細菌；簡化鑒定工序，操作方便，縮短時間，是一種能簡單、快速、有效鑒定產生長素內生菌的方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物
，特別涉及。
技術介紹
大量研宄證明有些植物內生細菌能夠通過生物固氮、產生植物激素等方式，促進宿主植物對營養物質的吸收并促進宿主植物生長發育及其他生理活動((I) Ansari, M.ff., D.K.Trivedi, et al.(2013).A critical review on fungi mediated plantresponses with special emphasis to Piriformospora indica on improved product1nand protect1n of crops.Plant Phys1logy and B1chemistry 70: 403-410.； (2)Rout, Μ.E.and T.H.Chrzanowski (2009).The invasive Sorghum halepense harborsendophytic N2-fixing bacteria and alters soil b1geochemistry.Plant and Soil315(1-2): 163-172.;(3)Rout，M.E.，T.H.Chrzanowskij et al.(2013).BacterialEndophytes Enhance Competit1n by Invasive Plants.American Journal of Botany100(9): 1726-1737.； (4) Waqasj M.，A.L Khan, et al.(2012).Endophytic FungiProduce Gibberellins and Indoleacetic Acid and Promotes Host—Plant Growthduring Stress.Molecules 17(9): 10754-10773.)。因此，現如今，越來越多的學者開始分離篩選植物內生細菌，并研宄其生物功能。其中，能夠產生促進植物生長的生長素的內生細菌受到包括農業在內眾多研宄領域的關注。通常，對產生長素的植物內生菌進行篩選的方法需經過分離、純化培養、再活化、發酵、顯色鑒定等過程。其中從再活化、發酵到最后的混合顯色鑒定，這個過程極其繁瑣，中間需更換多次不同成分的培養基及復雜的取樣步驟，而且此過程菌體生長緩慢，往往會消耗大量時間(約5~10天)。因此，傳統的植物內生細菌產生長素菌株的篩選方法既繁瑣又需耗費大量時間。那么，一種能夠快速、有效地鑒定產生長素的植物內生菌的方法在農業生產及相關科學研宄中很有必要。本專利技術提出了一種簡單直觀且快速的鑒定產生長素的植物內生細菌的方法，有目的地將能產生生長素的植物內生菌快速分離鑒定出來，能夠大大縮短其研宄周期、實驗成本，使之能盡快被應用到農業作物等實際生產中，能有效提高作物產量，從而極大促進農業生產水平。
技術實現思路
本專利技術提出了，能在短時間內有效鑒定出產生長素的植物內生細菌。本專利技術具有針對性強、周期短的特點。本專利技術的技術方案通過以下方式實現的: ，包括以下步驟: (I)培養基及顯色液的配制: 配制含有不同色氨酸濃度的改良的R2A分離鑒定培養基，具體配方如下:稱取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氫鉀、0.024 g無水硫酸鎂、0.3 g丙酮酸鈉、15 g瓊脂粉、0.5~2 g色氨酸，用雙蒸水定容至I L，并調pH至7.2，配成改良的R2A分離鑒定培養基，經115 °〇高壓滅菌15 min后，分裝倒入9 cm的無菌培養皿中，冷卻備用。配制生長素顯色液:2 mL的0.5 M氯化鐵溶液以及98 mL的體積分數為25~35%的高氯酸充分混勻。( 2 )植物組織的預處理: 選取生長良好的植物組織用蒸餾水沖洗干凈后，置于無菌操作臺中進行植物組織的表面消毒。由于消毒溶液濃度不夠或者消毒時間較短，不能完全殺死植物組織表面的微生物，從而影響內生細菌的篩選；而濃度過高或時間太長，則容易損壞植物組織甚至是殺死植物內生菌，因此，我們選用體積分數為70~75%的乙醇浸泡消毒約I min，并不斷攪拌，倒掉乙醇，加入體積分數為5~8%的次氯酸鈉溶液浸泡約6~10 min,并不斷震蕩，倒掉次氯酸鈉溶液，用滅菌蒸餾水沖洗約5次，置于無菌培養皿中，用剪刀將植物組織邊緣剪去，露出新鮮切口，并將切口貼在已倒好的改良R2A分離鑒定培養基上。將培養皿封口放入30 °C的培養箱中暗培養。(3)產生長素的內生細菌的分離與快速鑒定: 將植物組織切口附近生長出的單一植物內生細菌菌落標上序號，用接種環蘸取不同序號菌體，用劃線培養法得到單菌落；之后在長內生細菌的植物組織切口周圍噴施生長素顯色液，在30 V中進行暗反應，觀察周圍有粉紅色物質產生的菌落，此即是可產生長素的內生細菌。本專利技術的有益效果: 本專利技術提供的產生長素的植物內生細菌的分離方法，可以快速、直觀、有效鑒定出產生長素的內生細菌。傳統的產生長素的植物內生細菌的分離鑒定方法需經歷分離、純化培養、再活化、發酵以及顯色鑒定等過程，菌株分離純化與菌株產生長素能力鑒定兩部分被分割進行，即使除去分離純化步驟，菌株產生長素能力的鑒定步驟仍需耗費約5~10天。而本專利技術將分離培養基與產生長素鑒定培養基進行改良整合，在培養基中添加了生產生長素的前體一一色氨酸，并且在分離菌株后立即采用噴施法施用生長素顯色液(傳統方法需先對菌株進行發酵，之后對發酵液進一步處理后，才與顯色液混合反應)，一旦有內生細菌在培養過程分泌生長素，則顯色液可迅速與之發生顏色反應，能在5~10 min內快速辨別出能產生長素的內生細菌。本專利技術在菌株分離純化的基礎上，同時可進行菌株產生長素能力的鑒定，極大簡化了菌株產生長素能力的鑒定工序，最后菌株產生長素能力的鑒定步驟僅在5~10 min內即可完成。相比傳統的分離鑒定方法，本方法不僅由于簡化了鑒定工序而使得操作更為方便，也極大縮短了時間(僅大概為傳統鑒定方法所用時間的0.1%)，還因此可以減少相應的實驗成本。所以，本專利技術是一種能簡單、快速、有效地對產生長素內生細菌進行鑒定的方法。【附圖說明】圖1為產生長素內生細菌的快速篩選結果，其中(a)為植物內生細菌的生長；(b)為分泌生長素的內生細菌經顯色后可在周圍形成紅色物質。具體實施方法 下面根據具體實施例和附圖內容對本專利技術更好的說明，以便本領域技術人員更好的理解本專利技術的技術方案。實施例1: (I)培養基及顯色液的配制 配制含有0.05%色氨酸的改良的R2A分離鑒定培養基，具體配方如下:稱取0.5 g酵母提取物、0.5 g胰蛋白胨、0.5 g酪蛋白酸水解物、0.5 g葡萄糖、0.5 g可溶性淀粉、0.3 g磷酸二氫鉀、0.024 g無水硫酸鎂、0.3 g丙酮酸鈉、15 g瓊脂粉、0.5 g色氨酸，用雙蒸水定容至I L，并調pH至7.2，配成改良的R2A分離鑒定培養基，經115 °〇高壓滅菌15 min后，分裝倒入9 cm的無菌培養皿中，冷卻備用。配制生長素顯色液:2 mL的0.5 M氯化鐵溶液以及98 mL的體積分數為25%高氯酸充分混勻。(本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種快速鑒定產生長素的植物內生細菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）培養基及顯色液的配制：配制含有不同色氨酸濃度的改良的R2A分離鑒定培養基和生長素顯色液；其中改良的R2A分離鑒定培養基每1L含0.5~2g色氨酸；（2）植物組織的預處理：選取生長良好的植物組織用蒸餾水沖洗干凈后，置于無菌操作臺中進行植物組織的表面消毒；然后用剪刀將植物組織邊緣剪去，露出新鮮切口，并將切口貼在已倒好的改良R2A分離鑒定培養基上，將培養皿封口放入30?℃的培養箱中暗培養；（3）產生長素的內生細菌的分離與快速鑒定：將植物組織切口附近生長出的單一植物內生細菌菌落標上序號，用接種環蘸取不同序號菌體，用劃線培養法得到單菌落；之后立即在長內生細菌的植物組織切口周圍噴施生長素顯色液，在30?℃中進行暗反應，觀察周圍有粉紅色物質產生的菌落，此即是可產生長素的內生細菌。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：戴志聰，付偉，祁珊珊，王曉瑩，蔡紅紅，肖翔，杜道林，
申請(專利權)人：江蘇大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32