一種紅菇凝集素的制備方法及應用技術

本發明專利技術公開了一種紅菇凝集素的制備方法及應用，其制備方法首先將紅菇子實體粉碎，加入磷酸緩沖液低溫浸提，然后加入硫酸銨沉淀，再經離心透析脫鹽，通過DEAE離子交換層析、SephadexG-100凝膠層析等純化步驟獲得紅菇凝集素（RLN）。利用本發明專利技術提供的方法制備得到的紅菇凝集素具有抗菌活性，因此本發明專利技術在于紅菇活性成分多方位開發利用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物技術中功能蛋白制備方法，具體地說，涉及。
技術介紹
紅葫隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、紅葫目、紅葫科、紅葫屬(沿真菌，是一種美味的野生菌根性食藥兼用真菌。該紅菇多年來一直是容縣暢銷名產，成為人們饋贈親朋好友的佳品。由于此菇生境特殊，目前尚未能人工栽培，野生紅菇的價格年年攀升，野生紅菇的開發與利用已成為國內外學者們的研宄熱點。凝集素一類具有特異糖結合活性的蛋白，具有一個或多個可以與單糖或寡糖特異可逆結合的非催化結構域，廣泛存在于各種植物、動物、人體的組織器官、真菌和某些病毒中。凝集素最顯著的特點是具有細胞凝集能力，不僅能凝集紅細胞、腫瘤細胞、淋巴細胞、細菌、病毒等，還能特異性識別并結合細菌、病毒、腫瘤細胞表面的糖結構從而抵制其生長，因此凝集素被廣泛用于病原菌的防治、腫瘤的治療、含糖基生物大分子的檢測等方面。紅菇含有豐富的營養物質和生物活性物質，目前國內外尚未發現有關紅菇凝集素的所道。而本專利技術通過浸提、沉淀、透析脫鹽、離子交換層析、凝膠層析等過程獲得了紅菇凝集素并具有抑菌活性，因此本專利技術在于紅菇活性成分多方位開發利用。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供，通過本專利技術通過浸提、沉淀、透析脫鹽、離子交換層析、凝膠層析等過程獲得了紅菇凝集素并具有抑菌活性，從而實現了本專利技術的目的。本專利技術的，包括以下的工藝步驟: (I)凝集素粗品的提取:紅菇子實體稱重、粉碎、加入少量的磷酸鹽緩沖液，于高速組織搗碎機中搗碎，然后加入適量的磷酸鹽緩沖液，于2?6°C中浸提24?48h，四層紗布過濾，濾液經8000?12000r/min于4°C下離心20?40min，棄沉淀，收集上清液。加入固體硫酸銨至75%?80%飽和度，4°C下靜默12?24h，于4°C下以8000?12000r/min速度離心30?60min，收集沉淀物。加入少量的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，透析除鹽，檢測凝血活性，冷凍干燥，得到紅菇凝集素粗制品。(2)DEAE離子交換層析:取步驟(I)所得的紅菇凝集素粗制品，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，上樣于DEAE-纖維柱，上樣前柱材料先用磷酸鹽緩沖液平衡三個柱體積，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值為7.2的磷酸緩沖液以流速為30ml/h速度洗脫，將活力峰部分收集，透析除鹽，冷凍干燥。(3) SephadexG-1OO凝膠層析:用蒸餾水平衡柱子，洗脫液為pH值為7.2的0.15mol/L的磷酸緩沖液，流速為40ml/h，3ml/tube約5min收集I管。將活力峰部分收集，透析，冷凍干燥得到紅菇凝集素(RLN)。上述步驟(1)、(2)所述的磷酸鹽緩沖液指的是pH值為7.2的內含0.15mol/L NaCl的0.015mol/L的磷酸緩沖液。上述步驟(I)中浸提時的液料比為10:1。上述步驟(2)洗脫峰共有4個，其中活力峰指的是第4個洗脫峰。上述步驟(3)中將收集到的活力峰經過SephadexG-1OO分子篩層析后得到3個蛋白峰，其中活力峰指的是第2個蛋白峰。上述步驟(3)獲得的紅菇凝集素具有抑菌活性。本專利技術的優點是:將紅菇子實體粉碎，加入磷酸緩沖液低溫浸提，然后加入硫酸銨沉淀，再經離心透析脫鹽，通過DEAE離子交換層析、SephadexG-1OO凝膠層析等純化步驟獲得紅菇凝集素(RLN)。利用本專利技術提供的方法制備得到的紅菇凝集素具有抗菌活性，因此本專利技術在利于紅菇活性成分多方位開發利用。【附圖說明】圖1為本專利技術的凝血活性檢測示意圖。圖2為本專利技術的抑菌活性示意圖。【具體實施方式】以下實施例是對本專利技術的進一步說明，不是對本專利技術的限制。實施例1 (O凝集素粗品的提取:紅菇子實體稱重、粉碎、加入少量的磷酸鹽緩沖液(PBS, 0.015mol/L, pH7.2，內含0.15mol/L NaCl )，于高速組織搗碎機中搗碎，然后加入磷酸鹽緩沖液(液料比為10:1)，于2°C中浸提30h，四層紗布過濾，濾液經10000r/min于4°C下離心20min，棄沉淀，收集上清液。加入固體硫酸銨至75%飽和度，4°C下靜默12h，于4°C下以8000r/min速度離心45min，收集沉淀物。加入少量的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，透析除鹽，檢測凝血活性，冷凍干燥，得到紅菇凝集素粗制品。(2)DEAE離子交換層析:取步驟(I)所得的紅菇凝集素粗制品，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，上樣于DEAE-纖維柱，上樣前柱材料先用磷酸鹽緩沖液平衡三個柱體積，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值為7.2的磷酸緩沖液以流速為30ml/h速度洗脫，收集第4個洗脫峰部分透析除鹽，冷凍干燥。(3) SephadexG-1OO凝膠層析:用蒸餾水平衡柱子，洗脫液為pH值為7.2的0.15mol/L的磷酸緩沖液，流速為40ml/h，3ml/tube約5min收集I管。將收集第2個蛋白峰部分透析脫鹽，冷凍干燥得到紅菇凝集素(RLN)。對紅菇凝集素進行抑菌活性檢測(平板培養法)。實施例2 (O凝集素粗品的提取:紅菇子實體稱重、粉碎、加入少量的磷酸鹽緩沖液(PBS, 0.015mol/L, pH7.2，內含0.15mol/L NaCl )，于高速組織搗碎機中搗碎，然后加入磷酸鹽緩沖液(液料比為10:1 )，于4°C中浸提48h，四層紗布過濾，濾液經8000r/min于4°C下離心40min，棄沉淀，收集上清液。加入固體硫酸銨至80%飽和度，4°C下靜默30h，于4°C下以12000r/min速度離心30min，收集沉淀物。加入少量的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，透析除鹽，檢測凝血活性，冷凍干燥，得到紅菇凝集素粗制品。(2)DEAE離子交換層析:取步驟(I)所得的紅菇凝集素粗制品，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，上樣于DEAE-纖維柱，上樣前柱材料先用磷酸鹽緩沖液平衡三個柱體積，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值為7.2的磷酸緩沖液以流速為30ml/h速度洗脫，收集第4個洗脫峰部分透析除鹽，冷凍干燥。(3) SephadexG-1OO凝膠層析:用蒸餾水平衡柱子，洗脫液為pH值為7.2的0.15mol/L的磷酸緩沖液，流速為40ml/h，3ml/tube約5min收集I管。將收集第2個蛋白峰部分透析脫鹽，冷凍干燥得到紅菇凝集素(RLN)。對紅菇凝集素進行抑菌活性檢測(平板培養法)。【主權項】1.，其特征在于包括以下工藝步驟: 凝集素粗品的提取:紅菇子實體稱重、粉碎、加入少量的磷酸鹽緩沖液，于高速組織搗碎機中搗碎，然后加入適量的磷酸鹽緩沖液，于2?6°C中浸提24?48h，四層紗布過濾，濾液經8000?12000r/min于4°C下離心20?40min，棄沉淀，收集上清液，加入固體硫酸錢至75%?80%飽和度，4°C下靜默12?24h，于4°C下以8000?12000r/min速度離心30?60min，收集沉淀物，加入少量的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，透析除鹽，檢測凝血活性，冷凍干燥，得到紅菇凝集素粗制品； DEAE離子交換層析:取步驟(I)所得的紅菇凝集素粗制品，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，上樣于DEAE-纖維柱，上樣前柱材料先用磷酸鹽緩沖液平衡三個柱體積，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值為7.2的磷酸緩沖液以流速為30ml/h速度洗脫，將活力峰部分收集，透本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種紅菇凝集素的制備方法及應用，其特征在于包括以下工藝步驟：凝集素粗品的提取：紅菇子實體稱重、粉碎、加入少量的磷酸鹽緩沖液，于高速組織搗碎機中搗碎，然后加入適量的磷酸鹽緩沖液，于2～6℃中浸提24～48h，四層紗布過濾，濾液經8000～12000r/min于4℃下離心20～40min，棄沉淀，收集上清液，加入固體硫酸銨至75%～80%飽和度，4℃下靜默12～24h，于4℃下以8000～12000r/min速度離心30～60min，收集沉淀物，加入少量的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，透析除鹽，檢測凝血活性，冷凍干燥，得到紅菇凝集素粗制品；DEAE離子交換層析：取步驟（1）所得的紅菇凝集素粗制品，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，上樣于DEAE?纖維柱，上樣前柱材料先用磷酸鹽緩沖液平衡三個柱體積，然后以含有0.6mol/L?NaCl的pH值為7.2的磷酸緩沖液以流速為30ml/h速度洗脫，將活力峰部分收集，透析除鹽，冷凍干燥；SephadexG?100凝膠層析：用蒸餾水平衡柱子，洗脫液為pH值為7.2的0.15mol/L的磷酸緩沖液，流速為40ml/h，3ml/tube約5min收集1管，將活力峰部分收集，透析，冷凍干燥得到紅菇凝集素（RLN）。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：梁鈞淞，莫昭展，韋敏，甘耀坤，
申請(專利權)人：玉林師范學院，
類型：發明
國別省市：廣西;45