本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種利用風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶酶解金槍魚肝臟蛋白制備鈣螯合肽的方法，具體是以金槍魚肝臟為原料，通過雙酶酶解，超濾、大孔樹脂柱層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到鈣螯合肽Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp，ESI/MS檢測分子量為959.93?Da。鈣螯合肽對鈣螯合能力強(qiáng)，可同時(shí)補(bǔ)充多肽/氨基酸和鈣，是一種理想的補(bǔ)鈣物質(zhì)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【專利說明】一種金槍魚肝臟蛋白源鈣螯合肽及其制備方法和用途
本專利技術(shù)涉及一種金槍魚肝臟蛋白源鈣螯合肽及其制備方法和用途，屬于功能多肽制備
技術(shù)介紹
鈣是人體必需的元素，對血液凝結(jié)、神經(jīng)傳遞、激素釋放、乳汁分泌和肌肉收縮等方面均有影響。同時(shí)，鈣也是人類骨、齒的主要無機(jī)成分，約占人體質(zhì)量的1.4%，所以每天必須補(bǔ)鈣以維護(hù)人體中鈣的代謝平衡。但是，我國多數(shù)人群攝入乳制品的數(shù)量少，鈣補(bǔ)充不足，特別是在老人和兒童中缺鈣現(xiàn)象更是明顯。因此，提高鈣的攝入量及其在體內(nèi)的吸收利用度對于鈣的補(bǔ)充非常重要。在鈣螯合肽中，鈣元素嵌合在氨基酸或多肽中間，避免了鈣離子與食物中的酸性物質(zhì)(植物酸、草酸等)形成沉淀，同時(shí)也可以避免腸道堿性環(huán)境對于鈣的影響，顯著提高鈣離子的溶解度和穩(wěn)定性，提高其吸收利用率。因此，鈣螯合肽生物利用率高、吸收快，是一種理想的鈣補(bǔ)充劑。金槍魚是世界遠(yuǎn)洋漁業(yè)的重要魚類，據(jù)國際糧農(nóng)組織(FAO)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒的數(shù)據(jù)，近5年大洋金槍魚世界年產(chǎn)量均在650萬噸以上。金槍魚加工過程中，產(chǎn)生約占總重量8%的肝臟，未被有效利用。經(jīng)檢索，以金槍魚肝臟蛋白制備鈣螯合肽未見報(bào)道。基于此，本專利技術(shù)根據(jù)鈣螯合肽和金槍魚肝臟的利用現(xiàn)狀，提供一種金槍魚肝臟蛋白源鈣螯合肽，并提供這種鈣螯合肽的制備方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種金槍魚肝臟蛋白源鈣螯合肽。本專利技術(shù)所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種金槍魚肝臟蛋白源鈣螯合肽的制備方法。本專利技術(shù)為解決上述第一個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種金槍魚肝臟蛋白源媽螯合肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列為Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp(WDKENGPD), ES I/MS 檢測分子量為 959.93 Da。本專利技術(shù)為解決上述第二個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種金槍魚肝臟蛋白源鈣螯合肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: I)金槍魚肝臟蛋白酶解液的制備:金槍魚肝臟從冰凍金槍魚魚體中取出后，用高速組織搗碎機(jī)勻漿，并向勻漿中加入2~3倍體積的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0,0.02 mol/L)，加熱至50?60°C，恒溫?cái)嚢?5?30 min，然后按照肝臟濕重的0.5-1.0%向溶液中加入風(fēng)味蛋白酶，酶解4~6 h，然后將溫度升至55?65°C，按照肝臟濕重的0.8-1.2%向溶液中加入中性蛋白酶，酶解3~6 h后，9 OOO r/min離心25?30 min，取上清液，S卩為金槍魚肝臟蛋白酶解液。2)金槍魚肝臟鈣螯合肽的的制備:將制備的金槍魚肝臟蛋白酶解液采用5 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于5 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液按照體積比加入到裝有15?20倍AB-8大孔樹脂的層析柱中，用5?8倍柱體積水洗脫除去雜質(zhì)，然后用5?8倍柱體積的95%乙醇進(jìn)行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經(jīng)凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到金槍魚肝臟鈣螯合肽。作為優(yōu)選，所述步驟2)的凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為: 凝膠柱層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為20~25 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠LH-20柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)225 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高Ca螯合活性的峰為凝膠層析酶解物； RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80~100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對Ca的螯合活性得I個(gè)高Ca螯合活性多肽Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp (WDKENGPD)。再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量20~25 μ L ;色譜柱為Kromasil C18 (4.6mmX 250 mm, 5 μ m);流動(dòng)相:30%乙腈；洗脫速度1.0-1.5 mL/min ;紫外檢測波長225 nm。本專利技術(shù)基于多肽與金屬離子螯合的理論基礎(chǔ)，以及多肽-Ca螯合物的獨(dú)特功效(可同時(shí)補(bǔ)充多肽/氨基酸和Ca)，以金槍魚肝臟為原材料，通過對風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解條件控制，制備具有高Ca螯合活性的多肽。本專利技術(shù)即為補(bǔ)鈣保健食品和藥物開發(fā)提供了一種技術(shù)支持，同時(shí)也為金槍魚內(nèi)臟的高值化利用提供了一條新思路。【附圖說明】圖1是本專利技術(shù)的葡聚糖凝膠LH-20層析圖。圖2是本專利技術(shù)的葡聚糖凝膠LH-20制備酶解物的RP-HPLC色譜圖。圖3 是本專利技術(shù)的 Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp (WDKENGPD)的質(zhì)譜圖。【具體實(shí)施方式】以下結(jié)合實(shí)施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一種金槍魚肝臟蛋白源鈣螯合肽的制備方法，制備工藝流程如下:金槍魚肝臟〃酶解〃酶解物〃超濾〃大孔樹脂純化〃凝膠過濾層析"RP-HPLC制備〃鈣螯合肽。實(shí)施例: O金槍魚肝臟蛋白酶解液的制備:金槍魚肝臟從冰凍金槍魚魚體中取出后，用高速組織搗碎機(jī)勻漿，并向勻漿中加入3倍體積的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0,0.02 mol/L)，加熱至55°C，恒溫?cái)嚢?0 min，然后按照肝臟濕重的1.0%向溶液中加入風(fēng)味蛋白酶，酶解5 h，然后將溫度升至60°C，按照肝臟濕重的1.0%向溶液中加入中性蛋白酶，酶解6 h后，9 000 r/min離心25 min，取上清液，即為金槍魚肝臟蛋白酶解液。2)金槍魚肝臟鈣螯合肽的的制備:將制備的金槍魚肝臟蛋白酶解液采用5 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于5 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液按照體積比加入到裝有20倍AB-8大孔樹脂的層析柱中，用5倍柱體積水洗脫除去雜質(zhì)，然后用8倍柱體積的95%乙醇進(jìn)行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經(jīng)凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到金槍魚肝臟鈣螯合肽。利用氨基酸序列分析儀和質(zhì)譜測定其結(jié)構(gòu)，具體過程為: ①凝膠柱層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為20mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠LH-20柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)225 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高Ca螯合活性的峰為凝膠層析酶解物(F3)(圖1); ②RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成100μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC 進(jìn)行純化(條件:進(jìn)樣量 20 μ L ;色譜柱為 Kromasi I C18(4.6 mmX 250 mm,5 ym)；流動(dòng)相:30%乙腈；洗脫速度:1.5 mL/min ;紫外檢測波長:225 nm)，根據(jù)對Ca的螯合活性得I個(gè)高Ca螯合活性多肽(圖2)。③結(jié)構(gòu)檢測:Ca螯合肽經(jīng)檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為 Trp-Asp-Lys-Glu-Asn-Gly-Pro-Asp (WDKENGPD)，ESI/MS 檢測分子量為 959.93 Da(圖 3)0金屬螯合肽對鈣離子螯合能力的測定采用鄰-甲酚酞比色法。將I mL的CaCl2S液(5 mmol/L)和2 mL的磷酸鹽緩沖液(pH 8.0,0.2 mol/L)加入具塞試管中，再加入I mL多肽溶液，置于恒本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種金槍魚肝臟蛋白源鈣螯合肽，其特征在于該鈣螯合肽的氨基酸序列為Trp?Asp?Lys?Glu?Asn?Gly?Pro?Asp，ESI/MS檢測分子量為959.93?Da。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳倩倩，王斌，遲長鳳，鄧尚貴，孫坤來，
申請(專利權(quán))人：浙江海洋學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33
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