本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種酯酶基因estZ及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。所述酯酶基因estZ全長為1206bp，G?+?C含量65.2%，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼產(chǎn)物酯酶EstZ含401個氨基酸，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。EstZ能催化降解高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯鍵的農(nóng)藥。生產(chǎn)的酶制劑可用于蔬菜、水果、茶葉、棉花、煙草等農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留去除，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及增加附加值。酯酶基因estZ可進(jìn)一步用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因作物徹底解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題，生產(chǎn)無公害綠色農(nóng)產(chǎn)品；也可用于修復(fù)農(nóng)藥污染的土壤、水體等自然環(huán)境，解決環(huán)境污染問題，保護(hù)生態(tài)環(huán)境和人類健康。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及應(yīng)用環(huán)境微生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種酯酶基因^泛及其 編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。具體用于農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留的去除，生產(chǎn)無公害綠色農(nóng)產(chǎn)品；同時可 用于修復(fù)農(nóng)藥污染的土壤、水體等自然環(huán)境。
技術(shù)介紹
農(nóng)藥的專利技術(shù)和使用為人類的生存和發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)，特別是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、 農(nóng)作物病蟲害防治、雜草清除等方面發(fā)揮了巨大的作用，成為保障農(nóng)業(yè)豐收高產(chǎn)，解決人類 糧食問題不可或缺的重要條件之一。據(jù)統(tǒng)計，每年我國通過農(nóng)藥防治，糧食挽回約5845萬 噸、棉花101. 5萬噸、油料228. 5萬噸，每年挽回直接經(jīng)濟(jì)損失約800億元。農(nóng)藥的使用量 穩(wěn)步增長，已經(jīng)是提高農(nóng)民收入、促進(jìn)農(nóng)村消費(fèi)、保障國民經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定發(fā)展的必然選擇。但是， 農(nóng)藥的使用也是一把雙刃劍，由于農(nóng)藥的不科學(xué)使用特別是超劑量和超范圍使用致使農(nóng)藥 殘留問題日益突出，引起了一系列的食品安全問題和環(huán)境安全問題。一方面農(nóng)藥殘留污染 直接導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥超標(biāo)，產(chǎn)品品質(zhì)下降，嚴(yán)重威脅到人們的生命安全和我國農(nóng)副產(chǎn)品 的銷售。據(jù)統(tǒng)計，我國每年遭受殘留農(nóng)藥污染的作物面積超過10億畝。另一方面，環(huán)境中 殘留農(nóng)藥通過食物鏈富集最終進(jìn)入人體內(nèi)，直接威脅到人類的生命健康；此外，人類所施用 到田間的農(nóng)藥被植物體所截留的不足20%，有80%以上進(jìn)入環(huán)境中，不僅被植物體所截留的 部分會產(chǎn)生殘留毒性，而且進(jìn)入環(huán)境中的部分也會通過食物鏈達(dá)到生物富集，進(jìn)而產(chǎn)生殘 留毒性，給生態(tài)系統(tǒng)造成巨大的破壞。因此，消除環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留污染已成為科 研工作者亟待解決的具有重大經(jīng)濟(jì)和社會意義的科研命題。 生物降解技術(shù)（Biodegradation)可用于去除環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中各類有機(jī)污染物， 與傳統(tǒng)化學(xué)、物理處理方法相比具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。因此，研究利 用微生物降解菌劑或酶制劑產(chǎn)品治理農(nóng)藥殘留污染已成為近年來研究的熱點(diǎn)。目前許多發(fā) 達(dá)國家和大公司企業(yè)都投入巨資以從事農(nóng)藥殘留生物降解制劑的研究和開發(fā)，如美國BCI 公司、美國工程服務(wù)生物修復(fù)公司已經(jīng)將降解制劑產(chǎn)品規(guī)模化生產(chǎn)，國內(nèi)的北京佳農(nóng)新貿(mào) 易發(fā)展有限公司已成功生產(chǎn)"比亞"降解酶制劑可用于去除有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留。但是，目前 還沒有同時針對擬除蟲菊酯類和甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥殘留的生物降解制劑產(chǎn)品。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種新的降解農(nóng)藥的酯酶基因 該基因可用于農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留的去除，生產(chǎn)無公害綠色農(nóng)產(chǎn)品；同時可用于修復(fù)農(nóng) 藥污染的土壤、水體等自然環(huán)境。 本專利技術(shù)的另一目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。 本專利技術(shù)又一目的是提供該基因及其編碼的蛋白質(zhì)的應(yīng)用。 本專利技術(shù)的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 一種能降解含酯鍵農(nóng)藥的酯酶基因eWZ，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 本專利技術(shù)所述酯酶基因是從一株能夠降解含酯鍵農(nóng)藥的銅綠假單胞菌 (/ ?>5(9饑/6_/7<3>5<36?/7/ 1§7'/7〇>5<3)菌株？401中克隆得到。所述菌株已于2014年12月5日保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏號是CCTCC M 2014630。專利技術(shù)人通過質(zhì)譜分析 發(fā)現(xiàn)：菌株P(guān)A01可以使高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián) 苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯鍵的農(nóng)藥的酯鍵發(fā)生斷裂，使其失去農(nóng)藥毒 性。 從菌株中克隆酯酶基因M泛的具體方法為轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。菌株P(guān)A01能在基礎(chǔ) 培養(yǎng)基平板上利用高效氯氰菊酯等農(nóng)藥為唯一碳源生長，通過雙親株雜交使供體大腸桿菌 S17-1中的pBT20質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)座子mariner隨機(jī)插入PA01基因組后，利用轉(zhuǎn)座子上的慶大 霉素抗性基因和降解過程中產(chǎn)生水解圈與否篩選突變株，并利用Tail-PCR技術(shù)克隆出被 插入失活的基因片段，然后再進(jìn)行功能驗(yàn)證。 用上面的策略篩選到一株不能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基加農(nóng)藥的平板上產(chǎn)生水解圈的突 變株，進(jìn)一步的降解實(shí)驗(yàn)表明該突變子不能降解高效氯氰菊酯等農(nóng)藥。設(shè)計引物，進(jìn)行 Tail-PCR，多次PCR測序后，拼接結(jié)果表明插入位點(diǎn)為PA3734基因中間，該基因是功能未知 的酯酶基因，全長為1206bp (編碼401個氨基酸)，命名為mL?。這是一種新的降解農(nóng)藥的 酯酶基因。 一種能降解含酯鍵農(nóng)藥的酯酶Estz，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。 含有如上所述酯酶基因的重組克隆載體pUCP19- ￡^泛，將如上所述的酯酶基 因刀的核酸片段插入pUCP19的EcoR I和Xba I位點(diǎn)之間所得。 含有如上所述能降解含酯鍵農(nóng)藥的酯酶基因的重組表達(dá)載體 pET28a(+)-His-Pl，所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選將所述的酯酶基因的核苷酸片段插入 pET28a(+)的BamH I和EcoR I位點(diǎn)之間所得。 含有如上所述降解含酯鍵農(nóng)藥的酯酶基因的基因工程菌。 所述的基因工程菌優(yōu)選以大腸桿菌BL21為出發(fā)菌株。 如上所述酯酶基因在降解農(nóng)作物、農(nóng)產(chǎn)品、土壤或水體中含酯鍵農(nóng)藥的應(yīng) 用。 如上所述酯酶基因構(gòu)建降解含酯鍵農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。 如上所述酯酶Estz在去除農(nóng)作物、農(nóng)產(chǎn)品、土壤或水體中含酯鍵農(nóng)藥殘留的應(yīng) 用。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下有益效果： 1.本專利技術(shù)利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法成功從一株銅綠假單胞菌aerygifliosa)菌 株P(guān)A01中克隆出降解含酯鍵農(nóng)藥的酯酶基因eWZ。在GenBank比對結(jié)果表明該基因?yàn)橐?種新的降解農(nóng)藥的酯酶基因，全長(從起始密碼子到終止密碼子）為1206bp，G + C含量為 65. 2%，編碼401個氨基酸。 2.本專利技術(shù)提供的酯酶Estz能催化降解高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊 酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯鍵的農(nóng)藥。生產(chǎn) 的酶制劑可用于蔬菜、水果、茶葉、棉花或煙草等農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留去除，提高農(nóng)產(chǎn)品品 質(zhì)及增加附加值。 3.酯酶基因^泛可進(jìn)一步用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因作物，徹底解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留 超標(biāo)問題，生產(chǎn)無公害綠色農(nóng)產(chǎn)品；也可用于修復(fù)農(nóng)藥污染的土壤、水體等自然環(huán)境，解決 環(huán)境污染問題，保護(hù)生態(tài)環(huán)境和人類健康。【附圖說明】 圖1.酯酶基因隆的策略圖。 圖2?酯酶基因e>sdBL21 (pET28a(+))中表達(dá)策略圖。 圖3.酯酶EstZ蛋白電泳圖譜；其中泳當(dāng)前第1頁1 2 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種能降解含酯鍵農(nóng)藥的酯酶基因estZ，其特征在于，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張煉輝，陳少華，胡美英，常長青，鄧音樂，
申請(專利權(quán))人：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44
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