一種培養臍血類胚胎干細胞的方法及鑒定和應用技術

一種培養臍血類胚胎干細胞的方法及鑒定和應用，它涉及一種培養干細胞的方法及鑒定和應用。培養方法為：一、臍血的采集；二、臍血的分離；三、臍血類胚胎干細胞培養皿的包被；四、臍血類胚胎干細胞的培養擴增。本發明專利技術的臍血類胚胎干細胞用于輔助恢復損傷的淋巴細胞。本發明專利技術培養基配方采用了多種細胞因子，穩定細胞維持生物特性，促進細胞增殖。本發明專利技術采用laminin(層粘連蛋白)對培養皿進行包被，laminin有助于細胞貼壁，有效縮短了細胞貼壁時間，提高了細胞與皿底的粘連程度，使細胞貼壁更牢固。

【技術實現步驟摘要】
一種培養臍血類胚胎干細胞的方法及鑒定和應用
本專利技術涉及一種培養干細胞的方法及鑒定和應用。
技術介紹
Ⅰ型糖尿病(舊稱青少年糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)是糖尿病的一種類型，它與Ⅱ型糖尿病的發病機理完全不同，屬于自體免疫性疾病，可能是由于自體免疫系統破壞產生胰島素的胰腺胰島β細胞引起的。根據國際糖尿病聯合會(IDF)于2009年發布的數據，全世界目前約有3000萬1型糖尿病患者。Ⅰ型糖尿病主要有以下幾點患病因素：1)遺傳因素：國外報道約有25％～50％的人是由于遺傳因素導致患病，遺傳因素不論Ⅰ型或Ⅱ型均較肯定。據近代孿生兒研究，Ⅰ型中共顯性為50％，其余為環境因素；Ⅱ型中共顯性更高達90％以上。與I型糖尿病發病有關的是人類白細胞抗原(HLA)基因，HLA基因位于人類第6號染色體斷臂上，共有HLA—A、B、C、D(DR、DQ、DP)6個基因位點。HLA-A、B、C為I類抗原，正常時I類抗原基因可在所擁有核細胞表面(包括胰島素B細胞表面)表達，參與細胞介導免疫。HLA.D系列為Ⅱ類抗原，正常時只在B淋巴細胞、激活的T淋巴細胞、巨噬細胞、內皮細胞表面表達，胰島β細胞表面表達與自身免疫發病有關。大量HLA研究總結認為HLAD及DR抗原與Ⅰ型的關聯最為重要，尤其是DW3-DR3和DW4-DR4易患Ⅰ型糖尿病。最后又發現DQβ鏈變異體，與Ⅰ型糖尿病的關系較DR4更密切。DQβ57非天門冬氨酸和DQα52精氨酸可明顯增加Ⅰ型糖尿病的易感性，但其影響遠不如白種人顯著。Ⅱ型患者則HLA無特殊標志。2)自身免疫：與Ⅰ型患者關系密切。胰小島的自身免疫反應主要可能通過分子模擬(Mimicry)過程所致。如某抗原的化學和構成型與β細胞酷似，則該抗原產生的抗體也將針對β細胞發動免疫攻擊?？乖梢允遣《?，也可以是病毒以外的。至于病毒感染后，β細胞嚴重破壞而發生糖尿病的學說，在流行方式和病毒血清學研究中尚存在不一致。3)化學物質：對胰島β細胞有毒性的藥物和化學物質有四氧嘧啶、鏈脲佐菌素(STZ)戊雙咪、苯丙噻二嗪、噻唑利尿酮以及吡啶甲硝苯脲等均可損傷胰島β細胞，抑制胰島素的合成與分泌。自胰島素發現以來，皮下注射外源胰島素一直是治療l型糖尿病的最主要手段，雖然近年來隨著胰島素緩釋泵技術及基因工程改造的長效胰島素的廣泛應用，I型糖尿病患者的血糖控制效果較之前有了很大提高，但是I型糖尿病是一種機體免疫系統異常攻擊壞胰腺中產生胰島素細胞的疾病，這種方法既不能改善胰島功能也不能糾正異常免疫系統，所以無法達到治愈效果。在過去20多年中，隨著分子生物學技術的發展，科研工作者一直在嘗試用干細胞治療糖尿病，以恢復體內胰島素長期的合成與分泌，實現I型糖尿病在治愈水平上的技術突破。1991年，加拿大阿爾貝塔大學醫學院完成了世界上首次人胰島移植實驗。在使用抗免疫球蛋白、糖皮質激素、咪唑硫嘌呤等免疫抑制劑后，成功地將純化的人胰島細胞和一個腎臟移植入一名具有25年糖尿病史的35歲患者體內。手術后的幾個月內，患者完全擺脫了對外源胰島素的依賴。盡管由于I型糖尿病患者體內存在針對胰島細胞的抗體、機體自身的排異反應及免疫抑制劑對β細胞本身的毒害作用，接受胰島移植的患者在幾個月后又開始接受胰島素治療。但該手術的成功還是使人類在徹底根治I型糖尿病上邁出了歷史性的一步，也為糖尿病患者徹底擺脫依靠每天注射胰島素緩解病癥帶來了希望。在經過了近十年的探索后，阿爾貝塔大學醫學院的Shapiro及其同事于2000年在最權威的醫學刊物《新英格蘭醫學雜志》上報道：在使用不含糖皮質激素的一類包括sirolimus、taerolimis及daclizumab在內的新型免疫抑制劑的條件下，將分離的人胰島注射入糖尿病患者的肝門靜脈內，可以使胰島附著在肝竇區域并分泌胰島素。接受這種胰島移植的患者在平均11.9個月內(4.5一15個月)完全擺脫了對胰島素的依賴(Shapiro等.2000)，但是大部分患者在移植1年以后又開始接受外源胰島素治療，接受了胰島移植的患者不依賴胰島素的時間最長已經超過了5年，這種胰島移植的方法被稱為Edmontonprotocol。Edmontonprotocol還存在非常致命的缺點，包括sirolimus(rapamycin)對β細胞的毒性作用、胰島用量相對較大及純化過程的胰島應激損傷、同源胰島來源困難、移植后胰島存活率低、免疫抑制劑的副作用及移植成本高昂等。異種(如豬源)胰島移植研究歷史較長，但是也存在引入異種遺傳疾病和傳染性疾病的風險，且遭到有宗教信仰階層的排斥，因此雖是研究應用的一大方向，但是世界上目前并未有成熟的產品出現。國際上在干細胞移植治療糖尿病的研究中，主要以間充質干細胞、胰腺干細胞、脾臟干細胞、肝干細胞、肌源性干細胞、胚胎干細胞和造血干細胞研究為主。胚胎干細胞是目前研究最廣泛、最成熟的干細胞體系，現已能在體外成功分離、培養，并誘導為胰島素分泌細胞。2001年Assady等首次報道人胚胎干細胞所形成的擬胚體中有1％-3％細胞胰島素染色陽性，證實人胚胎干細胞可分化為胰島素分泌細胞。為了獲得較高比例的胰島素分泌細胞，人們采取了多種體外定向誘導分化的策略，Vaca和Lumelsky分別用不用的方法誘導胚胎干細胞定向分化為胰島分泌細胞。雖然目前的研究已經證實了人胚胎干細胞可以體外誘導分化為胰島樣細胞，但是仍然存在許多問題：1)宿主對hES分化細胞有免疫排斥作用；2)誘導分化效率低且不穩定度低；3)分化細胞的成熟性，有潛在的致瘤性。4)胚胎的來源途徑涉及到了倫理道德問題，因此研究及應用上受到限制，因此近期臨床意義不大。成體干細胞缺乏胰島細胞發育所必須信號，可能無法合成胰島素或缺乏對葡萄糖反應性。但是DIR科學家認為從一個相對成熟的細胞直接轉化成β細胞，可以減少成瘤性風險。成體干細胞應用臨床存在的問題：1)成體干細胞獲得途徑限制，數量少且增殖能力有限；2)缺乏特異性標記分子，分離、鑒定及純化比較困難；3)分化能力有限，并且具有較大變異度；缺乏有效的定向分化方案，分化細胞成熟度差。針對上述問題目前主要在以下方面突破：尋找理想的干細胞生長因子,促進干細胞在體外增殖，以彌補體內成體干細胞數量不足；明確調控胚胎發育中的關鍵信號分子,有助于尋找成體干細胞特異性的標記分子；對體外誘導分化方案進行優化，提高分化效率和分化細胞的成熟度。然而,目前在這些方面尚缺少重大的技術突破。目前進行的干細胞治療I型糖尿病臨床研究雖然在控制血糖水平都顯示一定的效果，但是都存在無法糾正患者異常的免疫功能的問題，所以這些方法只具有短期的血糖調節作用而無法保證長期作用。臍帶血是胎兒出生時，臍帶結扎并離斷后殘留在胎盤和臍血中的血液，通常是廢棄不用的。近十幾年的研究發現，臍帶血中含有多種干細胞，例如造血干細胞(HSC)、臍血類胚胎干細胞、間充質干細胞、血管內皮祖細胞(EPC)，干細胞衍生的單核細胞。經過研究發現類胚胎干細胞可以貼壁生長，可以顯示胚胎干細胞標記物(如轉錄因子Oct-4、nanog的階段特異性胚胎抗原SSEA-3和SSEA-4)和白細胞共同抗原CD45，但是臍血類胚胎干細胞不表達血細胞標記物(如CD3、CD8、CD11b、CD14、CD19、CD20、CD34、CD83、CD133)。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種培養臍血類胚胎干細胞的方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：一、臍血的采集二、臍血的分離將步驟一采集的臍血與分離液按體積比例為2:1混合，離心收集單核細胞層，隨后用紅細胞裂解液除去紅細胞，再用PBS清洗單核細胞2次，計數，將細胞密度調整至2×106/mL，備用；三、臍血類胚胎干細胞培養皿的包被首先將層粘連蛋白包被于皿底保持24h后，用PBS清洗2次，再用培養基平衡10～20min，然后將步驟二分離后的臍血細胞按1×105/mL接入皿底，其中，所述的層粘連蛋白首先用PBS配制成10倍濃度的層粘連蛋白溶液，于?20℃保存，使用時室溫融化后，再用PBS稀釋成1倍濃度的層粘連蛋白溶液使用；四、臍血類胚胎干細胞的培養擴增將步驟二細胞分離后的細胞接種在步驟三包被好的6孔培養板中，每孔接種2mL細胞懸液；然后將培養板放在溫度為37℃、質量百分含量為8％的CO2的培養箱中培養至融合率為70％～80％，然后按每孔培養后的細胞平均接種至兩孔的標準進行傳代培養，即完成所述的培養臍血類胚胎干細胞；其中，步驟三中的培養基配方如下：含有質量百分含量為87％的RPMI1640培養液、質量百分含量為10％的胎牛血清、質量百分含量為1％的非必需氨基酸、質量百分含量為1％的谷氨酰胺和質量百分含量為1％的β?巰基乙醇；并添加胰島素至終濃度為5ug/mL、bFGF至終濃度為20ng/mL、Vc至終濃度為50ug/mL和白血病抑制因子至終濃度為20ng/mL。...

【技術特征摘要】
1.一種培養的臍血類胚胎干細胞的應用，其特征在于它制備用于輔助恢復糖尿病人損傷的淋巴細胞的藥物，所述的臍血類胚胎干細胞的培養方法，是按照以下步驟進行的：一、臍血的采集二、臍血的分離將步驟一采集的臍血與分離液按體積比例為2:1混合，離心收集單核細胞層，隨后用紅細胞裂解液除去紅細胞，再用PBS清洗單核細胞2次，計數，將細胞密度調整至2×106/mL，備用；三、臍血類胚胎干細胞培養皿的包被首先將層粘連蛋白包被于皿底保持24h后，用PBS清洗2次，再用培養基平衡10~20min，然后將步驟二分離后的臍血細胞按1×105/mL接入皿底，其中，所述的層粘連蛋白首先用PBS配制成10倍濃度的層粘連蛋白溶液，于-20℃保存，使用時室溫融化后，再用PBS稀釋成1倍濃度的層粘連蛋白溶液使用；四、臍血類胚胎干細胞的培養擴增將步驟二細胞分離后的細胞接種在步驟三包被好的6孔培養板中，每孔接種2mL細胞懸液；然后將培養板放在溫度為37℃、質量百分含量為8%的CO2的培養箱中培養至融合率為70%~80%，然后按每孔培養后的細胞平均接種至兩孔的標準進行傳代培養，即完成培養臍血類胚胎干細胞；其中，步驟三中的培養基配方如下：含有質量百分含量為87%的RPMI1640培養液、質量百分含量為10%的胎牛血清、質量百分含量為1%的非必需氨基酸、質量百分含量為1%的谷氨酰胺和質量百分含量為1%的β-巰基乙醇；并添加胰島素至終濃度為5μg/mL、bFGF至終濃度...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張怡，蘆慧穎，劉艷青，
申請(專利權)人：黑龍江天晴干細胞股份有限公司，
類型：發明
國別省市：黑龍江;23