一種制備多肽藥物的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種制備多肽藥物DiaPep277的方法，包含：將Fmoc-Asp(OtBu)-OH與樹脂P偶聯(lián)，得到Fmoc-Asp(OtBu)-P；將Fmoc-Asp(OtBu)-P采用逐一偶聯(lián)的方式固相合成，得到DiaPep277-P；將DiaPep277-P裂解，得到DiaPep277粗肽。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種制備多肽藥物的方法，具體而言，涉及DiaPep277的制備方法。
技術(shù)介紹
DiaPep277是源自人熱休克蛋白60(HSP60)序列上的一段含24個氨基酸的肽段。DiaPep277的結(jié)構(gòu)如下：H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp-OH。研究證明，DiaPep277能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，使胰島細胞免受破壞并保護胰島素分泌功能。因此，DiaPep277為自身免疫性糖尿病患者的治療帶來實質(zhì)性的突破，并且可以作為這種糖尿病發(fā)病高危人群的預(yù)防性用藥。這種藥物可以明顯提高I型糖尿病患者的生存質(zhì)量，延緩或阻止各種并發(fā)癥的發(fā)生，以提高患者的預(yù)期壽命。
技術(shù)實現(xiàn)思路
對于含有24個氨基酸的短肽，由于固相方法存在操作簡便，溶劑使用量小，易于自動化等優(yōu)點，因此往往采用常規(guī)的保護氨基酸進行固相順序偶聯(lián)進行合成。但是，經(jīng)分析DiaPep277的肽鏈后，本專利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)，該肽鏈存在一些特殊的情況，大量的疏水性基團(特別是N端)及-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)的存在會使合成存在較大的困難。如果采用常規(guī)的Fmoc-Gly-OH原料容易在合成-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)時產(chǎn)生±Gly的雜質(zhì)等。本專利技術(shù)的目的在于采用特殊的氨基酸原料來解決上述困難，提高粗肽的純度與收率。本專利技術(shù)提供一種制備多肽藥物DiaPep277的方法，包含以下步驟：1)以一種樹脂P作為載體，將Fmoc-Asp(OtBu)-OH與樹脂偶聯(lián)，得到Fmoc-Asp(OtBu)-P；2)以Fmoc-Asp(OtBu)-P為原料，采用逐一偶聯(lián)的方式與其他氨基酸原料進行固相合成，得到DiaPep277-P；3)將DiaPep277-P裂解，得到DiaPep277粗肽；其中Fmoc為9-芴甲氧羰基，與氨基相連或與羧基所連的碳原子上的氮原子相連，其中步驟2)所述的逐一偶聯(lián)的方式中Asp-Ser結(jié)構(gòu)采用的合成原料是Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe，MePro)-OH，其為一個假脯氨酸二肽，使絲氨酸被保護成五元環(huán)，結(jié)構(gòu)如下：其中-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)采用的合成原料為Fmoc-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH或Fmoc-Gly-(Hmb)Gly-OH中的一種或兩種。優(yōu)選地，本專利技術(shù)方法還包括純化DiaPep277的步驟。具體實施方式對本專利技術(shù)中所用縮寫及其含義說明如下：本文中，“替代度”指的是單位量的樹脂負(fù)載的物質(zhì)的數(shù)量，單位為“mmol/g”。本文中，如無相反說明，則所述反應(yīng)在常溫常壓下進行。本專利技術(shù)中的寬泛的、優(yōu)選的、更優(yōu)選的、和最優(yōu)選的定義和范圍可以相互組合。本專利技術(shù)中“肽”是指類似地通過多肽合成中的Fmoc固相合成方法得到的偶聯(lián)產(chǎn)物。對所述載體樹脂無特別限定，只要其具有可與物質(zhì)中的羧基進行反應(yīng)的活性位點且不與所述物質(zhì)中的其他基團反應(yīng)即可。所述載體樹脂優(yōu)選為2-CTC樹脂或王樹脂兩類，樹脂替代度為0.2-1.0mmol／g，優(yōu)選為0.3-0.8mmol／g，更優(yōu)選為0.4-0.6mmol／g。本專利技術(shù)所用王樹脂類的結(jié)構(gòu)如下：所用2-CTC樹脂類的結(jié)構(gòu)如下：其中代表樹脂結(jié)構(gòu)的其余部分且該部分不參與反應(yīng)。上述兩種樹脂均可商購得到(天津南開和成科技有限公司)或按文獻已知的方法制備。在一個具體實施方案中，可根據(jù)樹脂的用量、反應(yīng)前的替代度以及所需的反應(yīng)后的替代度來選擇Fmoc-氨基酸-OH的用量，通常為樹脂上可與氨基酸偶聯(lián)的官能團的摩爾數(shù)的1-5當(dāng)量，優(yōu)選2-4當(dāng)量，更優(yōu)選2.5-3.5當(dāng)量，其中樹脂上可與氨基酸偶聯(lián)的官能團摩爾數(shù)為樹脂重量與替代度的乘積。所述溶劑為，例如，但不限于，DMF、DCM、DMSO、NMP、THF、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等及其任意混合物，優(yōu)選DMF、DCM，或DMF和DCM的混合液(例如，二者體積比為1：1)。偶聯(lián)制備肽樹脂可采用多肽合成領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的Fmoc固相合成方法來實現(xiàn)，例如可以參見文獻Fmoc?Solid?Phase?Peptide?Synthesis：A?Practical?Approach，W.C.Chan，Peter?D.White著，March2，2000(ISBN-10：0199637245)，英國Oxford?University?Press。偶聯(lián)中對樹脂的洗滌和溶脹可采用實現(xiàn)該目的的任何試劑進行，優(yōu)選DMF。所述偶聯(lián)在固相反應(yīng)柱中進行。對固相反應(yīng)柱無特別限制，可為可實現(xiàn)此目的的任意固相反應(yīng)柱。優(yōu)選地，將步驟1)-2)中物質(zhì)中的羧基進行活化，活化優(yōu)選在冰水浴中進行。活化劑優(yōu)選為DIPEA或DIC。其中在氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶聯(lián)至載體樹脂上之后，還包括向其中加入一種封閉液除去樹脂中過量的未反應(yīng)基團的步驟，以避免其在下一步偶聯(lián)反應(yīng)中與另外的待偶聯(lián)物質(zhì)反應(yīng)形成副產(chǎn)物，以及除去所加入的封閉液的步驟。當(dāng)所述載體樹脂為2-CTC樹脂時，所加入的封閉液優(yōu)選為甲醇；當(dāng)所述載體樹脂為王樹脂時，所加入的封閉液優(yōu)選為摩爾比為1：1的乙酸酐和吡啶。偶聯(lián)優(yōu)選在偶聯(lián)劑的存在下進行，所述偶聯(lián)劑優(yōu)選為DIC、A或其結(jié)合，或者為DIPEA、A、B或其結(jié)合，其中A為HOBt或HOAt，B為PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU和TBTU中的一種；例如，步驟1)中的偶聯(lián)劑為HOBt／DIC。步驟2)所述的Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe,Mepro)-OH的偶聯(lián)體系為HATU／HOAt／DIPEA、PyBOP／HOBt／DIPEA或TBTU／HOBt／DIPEA中的一種。步驟2)所述的逐一偶聯(lián)的方式中-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)采用的合成原料為Fmoc-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH或Fmoc-Gly-(Hmb)Gly-OH中的一種或兩種；優(yōu)選地，所述原料為選自Fmoc-(Hmb)Gly-OH和Fmoc-(Dmb)Gly-OH的一種，以及選自Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH和Fmoc-Gly-(Hmb)Gly-OH的一種。步驟2)所述的Gly合成原料的偶聯(lián)體系為DIC／H本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種制備多肽藥物DiaPep277的方法，包含以下步驟：1)以一種樹脂P作為載體，將Fmoc?Asp(OtBu)?OH與樹脂偶聯(lián)，得到Fmoc?Asp(OtBu)?P；2)以Fmoc?Asp(OtBu)?P為原料，采用逐一偶聯(lián)的方式與其他氨基酸原料進行固相合成，得到DiaPep277?P；3)將DiaPep277?P裂解，得到DiaPep277粗肽；其中Fmoc為9?芴甲氧羰基，與氨基相連或與羧基所連的碳原子上的氮原子相連，其中步驟2)所述的逐一偶聯(lián)的方式中Asp?Ser結(jié)構(gòu)采用的合成原料是Fmoc?Asp(OtBu)?Ser(ψMe，Mepro)?OH，其為一個假脯氨酸二肽，使絲氨酸被保護成五元環(huán)，結(jié)構(gòu)如下：其中?Gly?Gly?Gly?結(jié)構(gòu)采用的合成原料為Fmoc?(Hmb)Gly?OH、Fmoc?(Dmb)Gly?OH、Fmoc?Gly?(Dmb)Gly?OH或Fmoc?Gly?(Hmb)Gly?OH中的一種或兩種。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種制備多肽藥物DiaPep277的方法，包含以下步驟：
1)以一種樹脂P作為載體，將Fmoc-Asp(OtBu)-OH與樹脂偶聯(lián)，
得到Fmoc-Asp(OtBu)-P；
2)以Fmoc-Asp(OtBu)-P為原料，采用逐一偶聯(lián)的方式與其他氨
基酸原料進行固相合成，得到DiaPep277-P；
3)將DiaPep277-P裂解，得到DiaPep277粗肽；
其中Fmoc為9-芴甲氧羰基，與氨基相連或與羧基所連的碳原子上的
氮原子相連，
其中步驟2)所述的逐一偶聯(lián)的方式中Asp-Ser結(jié)構(gòu)采用的合成原
料是Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe，Mepro)-OH，其為一個假脯氨酸二肽，
使絲氨酸被保護成五元環(huán)，結(jié)構(gòu)如下：
其中-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)采用的合成原料為Fmoc-(Hmb)Gly-OH、
Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH或
Fmoc-Gly-(Hmb)Gly-OH中的一種或兩種。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括純化DiaPep277的步驟，純化優(yōu)選通
過重結(jié)晶方法或HPLC(例如反相HPLC)而進行。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)-3)均在室溫和常壓下進行；步
驟1)-2)的偶聯(lián)反應(yīng)在固相反應(yīng)柱中進行。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述樹脂P為2-CTC樹脂或王樹脂；
其中所述樹脂P的替代度為0.2-1.0mmol／g，優(yōu)選為0.3-0.8mmol／g，
更優(yōu)選為0.4-0.6mmol／g。
5.權(quán)利要求1的方法，其中步驟2)所述的逐一偶聯(lián)的方式中
-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)采用的合成原料為選自Fmoc-(Hmb)Gly-OH和
Fmoc-...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：宓鵬程，潘俊鋒，馬亞平，袁建成，
申請(專利權(quán))人：深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44