能用于過繼性細胞療法的多肽制造技術

本發明專利技術提供具有下式的多肽：St-R1-S1-Q-S2-R2，其中St是柄序列，當所述多肽在靶細胞表面表達時，其導致R和Q表位從細胞表面伸出；R1和R2是利妥昔單抗結合表位，其各自具有選自下組的氨基酸序列：SEQ?ID?No.1，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15和16或其保留利妥昔單抗結合活性的變體；S1和S2是任選的間隔序列，其可以是相同或不同的；且Q是具有如SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列的QBEnd10結合表位或保留QBEnd10結合活性的其變體。本發明專利技術還提供編碼這類多肽的核酸序列及其在過繼性細胞轉移中的用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】能用于過繼性細胞療法的多肽 專利
本專利技術涉及一種能用于過繼性細胞療法（ACT)的多肽。所述多肽包含能實現經轉 導細胞的選擇的表位，和使表達所述多肽的細胞被消除的表位。本專利技術還提供編碼這類多 肽的核酸，包含這類核酸的細胞及其治療用途。 專利技術背景 過繼性細胞療法（ACT)已顯示在臨床應用中針對惡性和感染性疾病的希望。例 如，已開發出埃巴病毒（Epstein-Barr virus)特異性細胞毒性T細胞（EBV-CTL)來治療 干細胞或器官移植后的移植后淋巴增殖性疾病（PTLD) (Brewin等（2009) 114:4792-4803)。 已使用經遺傳工程化以識別⑶19的T細胞來治療濾泡性淋巴瘤（Kochenderfer等（2010) Blood 116:4099-4102)。已利用使用遺傳修飾為表達抗腫瘤T細胞受體的自體淋巴細胞的 ACT 來治療轉移性黑素瘤（Rosenberg 和 Dudley (2009) Curr. Opin. Immunol. 21:233-240)。 根據報道，腫瘤抗原特異性T淋巴細胞成功用于治療黑素瘤和EBV相關惡性，這導 致為T效應細胞重新定目標，并由此擴大其能治療的腫瘤范圍的努力。 已經工程化改造 T細胞，其包含具有新特異性的T細胞受體（TCR)。還開發了嵌合 抗原受體（CAR)，其包含通常源自抗體的抗原結合域，該抗原結合域與源自T細胞受體的信 號轉導內域（endodomain)偶聯。如此，CAR具有與T細胞的細胞毒性效應器機制聯系的抗 體特異性。 許多臨床試驗正在進行中，其使用CAR修飾的T淋巴細胞進行B譜系惡性的 免疫治療（Kohn等（2011)Mol. Ther. 19:432-438)。經抗⑶2 CAR轉導的T細胞目前 正處在用于治療成神經細胞瘤（neuroblastoma)的臨床開發中（Pule等（2008)Nat. Med. 14:1264-1270)。在成人淋巴瘤的CAR臨床研究中也報道了顯示功效的數據。再 舉一個例子，用識別黑素瘤抗原的天然T細胞受體轉導的T細胞已導致散布性黑素瘤 (disseminated melanoma)的明顯消退。 自殺基因 提高過繼性免疫治療的功效已經與嚴重不良事件（adverse event)的報告聯 系起來。在輸注工程化的T細胞后，已報道有急性不良事件，如細胞因子風暴（cytokine storm)。另外，發生了慢性不良事件，并且其他通過動物模型預測。例如，由于在膽上皮上 預料不到的CAIX表達，再靶向碳酸酐酶IX(CAIX)(-種由腎癌表達的抗原）的T細胞在數 名患者中產生肝中毒。針對黑素瘤的天然T細胞受體轉移研究由于皮膚和虹膜上的靶抗原 表達而在患者中導致白癜風（vitiligo)和虹膜炎（iritis)。在天然TCR轉移后在小鼠中 報道了由于TCR交叉配對所致的移植物抗宿主病（GvHD)樣癥狀。報道了在使用納入共刺 激的一些CAR的過繼性轉移后在動物模型中的淋巴增殖性病癥。最后，載體插入性誘變的 風險始終存在。雖然急性毒性可通過小心給藥來解決，但慢性毒性可能是不依賴于細胞劑 量的。 由于工程化的T細胞在施用后能擴充并持續數年，期望在面臨毒性時納入安全性 機制以允許過繼性輸注的T細胞的選擇性缺失。 自殺基因使得能夠在體內選擇性缺失經轉導的細胞。有兩種自殺基因處于臨床測 試中：HSV-TK 和 iCasp9。 T細胞中的單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK)表達賦予對更昔洛韋（Ganciclovir) 的易感性。HSV-TK使用局限于深度免疫抑制的臨床背景如單倍體相合骨髓移植 (haploidentical bone marrow transplantation)，因為該病毒蛋白質是高度免疫原性的。 另外，它排除了將更昔洛韋用于巨細胞病毒治療。 最近，描述了可誘導的胱天蛋白酶9(iCasp9)，其可通過施用小分子藥物 (AP20187)激活。iCasp9的使用依賴于臨床級AP20187的可用性。另外，在遺傳工程化細 胞產品外的實驗小分子的使用可能導致管理問題。 因此，需要改進的自殺基因，其克服了與免疫原性和與已知自殺基因有關的誘導 藥物的可用性有關的問題。 標志基因 為了最大化過繼性細胞療法的效率，期望具有用于監測轉導效率和選擇經轉導細 胞的機制。然后可將純化的經轉導細胞的群體給予患者。 一些T細胞工程化策略不導致容易檢出的表面蛋白質的轉基因表達。在這些情況 中，難以進行轉導測量和外周血中細胞的追蹤。另外，在一些背景中，需要僅施用轉導的T 細胞，例如在GvHD基因治療方案中。此時，需要允許臨床級分選的標志物。 已描述了幾種標志基因。第一種是新霉素抗性基因，其現在具有歷史性興趣，因為 該異種（xenogeneic)蛋白質僅允許通過抗生素選擇的緩慢分選。還提出了低親和力神經 生長因子受體。盡管是非免疫原性的，但其表明預料不到的生物學效果。 最近，已經將截短的⑶34用作標志物。這具有如下的優點，即⑶34 Miltenyi CliniMACS選擇系統可容易地用于臨床級分選。然而，已報道⑶34轉基因的納入可導致經 轉導 T 細胞的異常歸巢（homing) (Lange 等（2007) Stem Cells Dev. 16:297-304)。 還有，甚至截短的⑶34也具有較長的編碼序列，將該蛋白質作為標志基因納入可 能加重載體包裝容量和轉錄效率的負擔。 因此，需要改進的標志基因，其克服了與已知標志基因有關的免疫原性、預料不到 的生物學活性和長編碼序列相關的問題。 附圖簡述 圖I :QBEND10與全長CD34(CD34)的結合，表位經由接頭（QL8)、不經接頭（Q8)融 合至CD8柄（stalk)，或直接融合至CD8 a跨膜域（Q)。使用的逆轉錄病毒載體共表達eGFP。 結論是QBEND10的有效結合需要間隔區，但柔性接頭不然。 圖2 :使用Miltenyi⑶34選擇試劑盒將用低滴度上清液轉導的T細胞富集至接 近純。 圖3 :對利妥昔單抗結合物的不同嘗試，結合通過FACS顯示，如下：(a)全長⑶20。 剩余部分均附接CD8柄。（b) CD20的主要胞外環，在二硫鍵任一側包含5個殘基；（c)來自 二硫鍵半胱氨酸的CD20的主要胞外環；（d)來自Perosa (2007, J. Immunol 179:7967-7974) 的環狀模擬位（mimetope) ;(e)來自Perosa(2007,如上文）的線性模擬位。選擇構建 體（d)，因為其他構建體不能結合、結合較差或產生兩階段結合模式（bi-phasic binding pattern)〇 圖4 :(a)顯示RQR8結構的草圖；(b)將QBEND10結合與全長CD34的結合比較 (左）；將利妥昔單抗對RQR8的結合與全長CD20的結合比較（右）。注意共表達eGFP。（c) 在活細胞上暴露于補體和利妥昔單抗門孔后的殺傷效率顯示實際上所有經轉導T細胞的 消除。 圖5 : (a)通過FACS檢測的在人T細胞上第三代抗GD2 CAR的表達，和（b)在針 對GD2+靶細胞系的鉻釋放測定法中未轉導的T細胞（NT)、抗CD19 T細胞和抗GD2 T細胞 (HuK)的功能。（c)通過四聚體本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種具有下式的多肽：St?R1?S1?Q?S2?R2其中St是柄序列，當所述多肽在靶細胞表面表達時，該柄序列導致R和Q表位從所述細胞表面伸出；R1和R2是利妥昔單抗結合表位，它們各自具有選自下組的氨基酸序列：SEQ?ID?No.1，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15和16或其保留利妥昔單抗結合活性的變體；S1和S2是任選的間隔序列，其可以是相同或不同的；且Q是具有如SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列的QBEnd10結合表位或保留QBEnd10結合活性的其變體。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.04.13 GB 1206559.51. 一種具有下式的多肽： St-Rl-Sl-Q-S2-R2 其中 St是柄序列，當所述多肽在靶細胞表面表達時，該柄序列導致R和Q表位從所述細胞表 面伸出； Rl和R2是利妥昔單抗結合表位，它們各自具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID No. 1， 6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15和16或其保留利妥昔單抗結合活性的變體； Sl和S2是任選的間隔序列，其可以是相同或不同的；且 Q是具有如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的QBEndlO結合表位或保留QBEndlO結合活 性的其變體。2. 根據權利要求1的多肽，其中Rl和R2之間的距離過長使得所述多肽不能同時結合 利妥昔單抗的兩個抗原結合位點。3. 根據權利要求2的多肽，其中所述間隔序列Sl和S2具有至少約10個氨基酸的聯合 長度。4. 根據前述權利要求中任一項的多肽，其中Rl和R2之間的距離超過76.57Ju5. 根據前述權利要求中任一項的多肽，其中所述柄序列能從CDSalpha衍生。6. 根據權利要求5的多肽，其中所述柄序列包含如SEQ ID No. 3顯示的氨基酸序列。7. 根據前述權利要求中任一項的多肽，其包含如SEQ ID No. 4顯示的序列或其變體，該 變體與以SEQ ID No. 4顯示的序列具有至少80%同一性，且該變體（i)結合QBEND10 ;(ii) 結合利妥昔單抗，和（iii)當在細胞表面上表達時，在利妥昔單抗存在的情況下誘導補體 介導的細胞殺傷。8. -種融合蛋白，其包含與目的蛋白質（POI)融合的根據前述權利要求中任一項的多 肽。9. 根據權利要求8的融合蛋白，其中所述POI是嵌合抗原受體（CAR)或T細胞受體 (TCR)。10. 根據權利要求8或9的融合蛋白，其包含在所述多肽與所述目的蛋白質之間的自身 切割肽。11. 一種核酸序列，其能編碼根據權利要求1至7中任一項的多肽或權利要求8至10 中任一項的融合蛋白。12. -種包含根據權利要求11的核酸序列的載體。13. 根據權利要求12的載體，其還包含目的轉基因。14. 根據權利要求13的載體，其中所述目的轉基因編碼嵌合抗原受體或T細胞受體，從 而當使用所述載體轉導...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M普利，B菲利普，
申請(專利權)人：UCL商務股份有限公司，
類型：發明
國別省市：英國;GB