本發明專利技術公開一種高效富集微生物的功能化磁性納米粒子及制備與應用。基于該功能化磁性納米粒子對食品中的微生物進行高效富集和核酸檢測的方法，主要的步驟包括：(1)對磁性納米粒子進行修飾及功能化；(2)在液體環境中對食品中的微生物進行磁富集；(3)對富集到的細菌進行基因組分離、純化；(4)對分離純化的細菌基因組進行基于PCR的核酸檢測。該方案可在短時間內對食品中的致病性細菌進行高效的富集，并從富集到細菌中分離純化到高質量的基因組模板，進行核酸檢測。相對于傳統的方法更加快速，節省了大量的人力、物力，可以對食品中低濃度的致病菌進行有效地檢出，檢測結果也更為可靠，易于在生產、生活、科研等領域的推廣和應用。
【技術實現步驟摘要】
一種高效富集微生物的功能化磁性納米粒子及制備與應用
本專利技術屬于生物檢測
，特別涉及一種高效富集微生物的功能化磁性納米 粒子及制備與應用。
技術介紹
隨著社會進步，食品安全日益受到人們重視，尤其是食品中的致病性細菌對人們 的健康產生了嚴重的威脅。目前主要的檢測方法都是通過培養基增菌、平板菌落形態觀察 來對微生物進行檢測，這種方法相對可靠，但也有這明顯的不足。培養基增菌、單菌落劃分 以及鑒定往往需要5天以上的時間，這已經無法滿足現在市場高流通性和時效性的需求， 無法對食品致病菌的傳染進行有效預防。同時，基于菌落形態的檢測更是不甚可靠，也需要 專業的人士來操作。因此，開發一種能對食品致病菌進行快速、可靠檢測的方案顯得尤為迫 切。增菌往往需要很久的時間，而富集則相反，只需要將一定體系中的病原菌進行有效的 集中即可。現在已經出現了多種對細菌的富集方式，主要是通過基于抗體、適配體、抗生素、 化學基團等和細菌能特異性結合的方式，但這些方法也都存在著一些問題，比如抗體價格 較高且只能識別單一的細菌，同時不方便儲存和運輸；抗生素比如萬古霉素修飾的納米磁 珠會因為修飾作用改變磁珠表面的性質使之在液體中的分散性減弱，對細菌的捕獲效率下 降；化學基團比如氨基往往是通過電荷作用對表面帶負電的細菌進行結合，而這導致了無 法有效分離純化捕獲細菌的基因組，致使后續無法對捕獲到的細菌進行核酸層面的檢測。 這些缺陷都導致了目前用于富集的磁珠無法在實際生活、生產中得到有效地應用。因此開 發出一種性質穩定、易于儲存、運輸，能對細菌進行廣譜、高效率富集，且不影響后續對細菌 基因組進行核酸檢測的功能化納米磁珠具有重要的社會意義和經濟價值。
技術實現思路
為了克服現有技術的缺點與不足，本專利技術的首要目的在于提供一種高效富集微生 物的功能化磁性納米粒子的制備方法。 本專利技術的另一目的在于提供通過上述制備方法得到的功能化磁性納米粒子。該功 能化磁性納米粒子能對食品中的致病性細菌進行高效富集和核酸檢測。 本專利技術的另一目的在于提供一種基于上述功能化磁性納米粒子對食品中的微生 物進行高效富集和核酸檢測的方法。 本專利技術的目的通過下述技術方案實現：一種高效富集微生物的功能化磁性納米粒 子的制備方法，包括如下步驟： 通過氨基、羧基脫水縮合作用將萬古霉素修飾到氨基磁珠上，再用一端羧基活化 的聚乙二醇（PEG)對磁珠上剩余的氨基位點進行封閉；即得到能高效富集微生物的功能化 磁性納米粒子。 所述的氨基磁珠為購自天津倍思樂公司的四氧化三鐵磁性納米微球，表面基 團：-NH2，粒徑為100?200nm，濃度為5mg/mL，分散于PBS緩沖液中；四氧化三鐵磁性納米 微球，其英文全稱是Fe3O4Hiagnetic nanoparticles，簡寫為Fe3O4MNPs,本專利技術中MNPs代指 Fe3O4MNPs ； 所述的PBS緩沖液是I XPBS緩沖液，pH值為7. 4?7. 6 ;所述的PBS緩沖液的母 液為20 XPBS緩沖液，pH值為7. 4?7. 6,購自生工生物工程（上海）股份有限公司； 所述的一端羧基活化的PEG優選為其分子量是2000?6000 ;更優選為5000 ; 所述的一端羧基活化的PEG更優選為單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯 (mPEG-SC)，分子量為5kDa，購自中科院過程工程研究所； 所述的氨基、羧基脫水縮合作用的反應步驟及體系如下： 1)取氨基磁珠，進行磁富集，加入30mM/pH6的MES緩沖液清洗三次并重懸于 30mM/pH6的MES緩沖液中； 2)稱取萬古霉素鹽酸鹽，N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)，1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙 基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC · HC1); 3)將步驟1)中的氨基磁珠和步驟2)中的藥品均勻混合并加入30mM/pH6的MES 緩沖液，得到混合液，反應； 4)反應完成后，對磁珠進行磁分離，30mM/pH6的MES緩沖液清洗三次，并重懸于 30mM/pH6MES緩沖液中，得到修飾上萬古霉素的納米磁珠； 所述的30mM/pH6的MES緩沖液通過如下步驟制備：取30mmol/L的MES，溶解于去 離子水中，調pH值為6. 0,得到30mM/pH6的MES緩沖液；其中，MES即2- (N-嗎啡啉）乙磺 酸，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司； 步驟1)中所述的氨基磁珠，粒徑為100?200nm，濃度為5mg/mL，分散于PBS緩沖 液中，與步驟2)中所述的萬古霉素鹽酸鹽的體積質量比優選為（400?425)mL:3g; 步驟2)中所述的萬古霉素鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)和1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC · HC1)的質量比優選為3: (5?7) : (7?9); 步驟3)中所述的混合液中萬古霉素鹽酸鹽的濃度優選為3?6g/mL ; 步驟3)中所述的反應的條件優選為20?30°C、170?190rpm反應5h?7h ; 步驟4)中所述的重懸于30mM/pH6MES緩沖液，其中，MES緩沖液的體積與步驟3) 中所述的混合液的體積比優選為1 :1 ; 所述的封閉的反應步驟及體系如下：取上述萬古霉素修飾的納米磁珠5mL，稱取 0. 025g -端羧基活化的PEG，混合均勻，反應；反應完成后，對磁珠進行磁分離，30mM/pH6的 MES緩沖液清洗三次，并重懸于5mL 30mM/pH6MES緩沖液中，得到萬古霉素和PEG雙重修飾 的納米磁珠，即能高效富集微生物的功能化磁性納米粒子； 所述的反應的條件優選為20?30°C、170?190rpm反應Ilh?13h ; -種高效富集微生物的功能化磁性納米粒子，通過上述制備方法得到； -種基于上述功能化磁性納米粒子對食品中的微生物進行高效富集和核酸檢測 的方法，具體包括如下步驟： (1)在液體環境中對食品中的微生物進行磁富集 取一定濃度梯度的細菌菌液分散到LB培養基中，向其中加入上述功能化磁性納 米粒子，震蕩反應，進行磁富集，然后進行磁分離，最后將捕獲到細菌的納米粒子重新分散 到30mM/pH6的MES緩沖液中，清洗3次，收集納米粒子/細菌復合物； (2)對富集到的細菌進行基因組分離、純化 通過酶解法對步驟（1)收集的納米粒子/細菌復合物中富集到的細菌進行裂解， 然后通過磁分離將磁珠和細胞裂解液分開，再對細胞裂解液中的細菌基因組進行分離純 化； (3)對分離純化的細菌基因組進行基于PCR的核酸檢測 通過針對待測細菌進行優化設計的引物對步驟（2)中分離純化的細菌基因組進 行PCR擴增，得到特定長度PCR產物，并進行凝膠電泳以及紫外照膠顯影實驗； 所述的細菌優選為單增李斯特菌（Listeria monocytogenes); 步驟⑴中所述的一定濃度梯度的細菌菌液為，在IOmL LB培養基中進行過夜培 養的細菌，〇〇600為1，濃度約為1\108〇包/11^，取11^上述菌液10000印111，41：離心21^11， 收集沉淀，重懸于ImL 30mM MES/0. IM NaCl pH本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種高效富集微生物的功能化磁性納米粒子的制備方法，其特征在于包括如下步驟：?通過氨基、羧基脫水縮合作用將萬古霉素修飾到氨基磁珠上，再用一端羧基活化的聚乙二醇對磁珠上剩余的氨基位點進行封閉；即得到能高效富集微生物的功能化磁性納米粒子。
【技術特征摘要】
1. 一種高效富集微生物的功能化磁性納米粒子的制備方法，其特征在于包括如下步 驟： 通過氨基、羧基脫水縮合作用將萬古霉素修飾到氨基磁珠上，再用一端羧基活化的聚 乙二醇對磁珠上剩余的氨基位點進行封閉；即得到能高效富集微生物的功能化磁性納米粒 子。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述的氨基磁珠為四氧化三鐵磁性 納米微球，表面基團：_NH2,粒徑為100?200nm，濃度為5mg/mL，分散于PBS緩沖液中； 所述的一端羧基活化的聚乙二醇為其分子量是2000?6000。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述的氨基、羧基脫水縮合作用的反 應步驟及體系如下： 1) 取氨基磁珠，進行磁富集，加入30mM/pH6的MES緩沖液清洗三次并重懸于30mM/pH6 的MES緩沖液中； 2) 稱取萬古霉素鹽酸鹽，N-羥基琥珀酰亞胺，1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽； 3) 將步驟1)中的氨基磁珠和步驟2)中的藥品均勻混合并加入30mM/pH6的MES緩沖 液，得到混合液，反應； 4) 反應完成后，對磁珠進行磁分離，30mM/pH6的MES緩沖液清洗三次，并重懸于30mM/ PH6MES緩沖液中，得到修飾上萬古霉素的納米磁珠。4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟1)中所述的氨基磁珠與步驟2) 中所述的萬古霉素鹽酸鹽的體積質量比為（400?425)mL :3g ; 步驟2)中所述的萬古霉素鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和I-(3-二甲氨基丙基）-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽的質量比為3: (5?7) : (7?9); 步驟3)中所述的混合液中萬古霉素鹽酸鹽的濃度為3?6g/mL。5. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述的封閉的反應步驟及體系如下： 取上述萬古霉素修飾的納米磁珠5mL，稱取0. 025g -端羧基活化的PEG，混合均勻，反應； 反應完成后，對磁珠進行磁分離，30mM/pH6的MES緩沖液清洗三次，并重懸于5mL 30mM/ PH6MES緩沖液中，得...
【專利技術屬性】
技術研發人員：邢達，周小明，朱敏君，
申請(專利權)人：華南師范大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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