使用XPD解旋酶表征多核苷酸的方法技術

本發明專利技術涉及一種新的表征目標多核苷酸的方法。所述方法利用孔和XPD解旋酶。所述解旋酶控制目標多核苷酸穿過所述孔的移動。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】使用XPD解旋酶表征多核苷酸的方法
本專利技術涉及一種新的表征目標多核苷酸的方法。該方法使用孔及XPD解旋酶。解旋酶控制所述目標多核苷酸穿過所述孔的移動。
技術介紹
當前需要一種適合于各種應用的快速且廉價的多核苷酸(例如DNA或RNA)測序和鑒定的技術。現有技術很慢并且昂貴，這主要是因為它們依賴于擴增技術來產生大量的多核苷酸并需要大量專門的熒光化學物質來檢測信號。當跨膜孔(納米孔)具有極大的用作聚合物及多種小分子的直接的電生物傳感器的潛力。特別是，最近關注的是將納米孔作為潛在的DNA測序技術。當跨納米孔施加電勢時，當分析物，如核苷酸，在桶內短暫停留一定時間段后，電流會發生變化。納米孔檢測核苷酸得到已知標志(signature)的電流變化和持續時間。在“鏈測序”(“StrandSequencing”)方法中，使單個多核苷酸鏈穿過孔，得到對該核苷酸的鑒定。鏈測序可包括，使用核苷酸調控蛋白來控制多核苷酸穿過孔的運動。
技術實現思路
本專利技術已經證明了XPD解旋酶可控制多核苷酸穿過孔的運動，尤其是當對所述孔施加電勢，例如電壓時。解旋酶能夠以可控和逐步的方式逆著或順著由施加電壓得到的場移動目標多核苷酸。出人意料的是，解旋酶能夠在高鹽濃度下起作用，所述高鹽濃度對表征多核苷酸有利，特別是對使用鏈測序確定其序列有利。這將在下面更詳細地討論。因此，本專利技術提供了一種表征目標多核苷酸的方法，包括：(a)使目標多核苷酸與跨膜孔及XPD解旋酶接觸，使得目標多核苷酸移動穿過所述跨膜孔，并使XPD解旋酶控制目標多核苷酸穿過所述跨膜孔的移動；和(b)當所述目標多核苷酸相對于所述跨膜孔移動時，獲取一個或多個測量值，其中所述測量值代表所述目標多核苷酸的一個或多個特征并由此表征所述目標多核苷酸。本專利技術還提供了：-一種形成用于表征目標多核苷酸的傳感器的方法，包括在孔和XPD解旋酶之間形成復合體并從而形成用于表征目標多核苷酸的傳感器；-XPD解旋酶在控制目標多核苷酸穿過孔的運動中的應用；-一種表征目標多核苷酸的試劑盒，其包括(a)孔和(b)XPD解旋酶；和-一種用于表征樣本中目標多核苷酸的分析裝置，包括多個孔和多個XPD解旋酶；-一種表征目標多核苷酸的方法，包括：(a)使目標多核苷酸與XPD解旋酶接觸，使得XPD解旋酶控制所述目標多核苷酸的運動；和(b)當XPD解旋酶控制所述目標多核苷酸的運動時，獲取一個或多個測量值，其中所述測量值代表所述目標多核苷酸的一個或多個特征并從而表征所述目標多核苷酸；-XPD解旋酶在表征目標多核苷酸過程中控制目標多核苷酸的運動中的應用；-XPD解旋酶在對目標多核苷酸的一部分或全部進行測序的過程中，控制目標多核苷酸的運動中的應用；-一種用于表征樣本中目標多核苷酸的分析裝置，其特征在于其包括XPD解旋酶；和-一種表征目標多核苷酸的試劑盒，包括(a)用于表征所述目標多核苷酸的分析裝置和(b)XPD解旋酶。附圖說明圖1A)為使用解旋酶控制DNA移動穿過納米孔的實施例的示意圖。反側的箭頭顯示了DNA的運動方向。順側的箭頭顯示了解旋酶相對于DNA的運動方向。從左到右，具有含膽固醇標簽的退火引物的單鏈DNA底物(圖1B)被添加到雙分子層的順側。膽固醇標簽結合到雙分子層，將所述底物富集在雙分子層表面。添加到順式隔室(ciscompartment)的解旋酶結合到DNA。在二價金屬離子和NTP底物存在時，解旋酶沿著DNA移動。在施加的電壓下，所述DNA底物經DNA上的前導區部分被納米孔捕獲。在施加的電勢的力的作用下，所述DNA被牽拉穿過所述納米孔直到結合到DNA上的解旋酶與所述孔的頂部接觸，防止進一步的不受控的DNA移位。所述解旋酶沿著所述DNA以5’到3’的方向運動，便于使螺旋狀(threaded)DNA順著施加的電場受控移位而穿過所述納米孔。所述解旋酶促使DNA移位穿過納米孔，使其進入反式隔室。穿過納米孔的DNA的最后部分為3’端。當解旋酶已促使DNA穿過納米孔的移位完成時，該解旋酶從該鏈上解離。圖1B為在本實施例中使用的DNA底物設計之一。圖2顯示了解旋酶能夠以受控方式使DNA移動穿過納米孔，隨著DNA移動穿過納米孔，電流發生逐步變化。示例解旋酶-DNA事件(140mV,400mMNaCl,HepespH8.0,0.6nM400merDNA,100nMXPDMbu,1mMDTT,1mMATP,1mMMgCl2)。上部)為，獲得的XPD400merDNA事件穿過MspAB2納米孔的電流對時間的分圖。開孔電流為～95pA。在施加的電勢(+140mV)的力的情況下，DNA被納米孔捕獲。連接有酶的DNA得到長的模塊(block)(在該條件下，在～25pA)，隨著酶使DNA移動穿過所述納米孔，該模塊顯示出逐步變化的電流。下部)，該下分圖顯示了解旋酶控制DNA運動事件之一的放大圖，示出了DNA-酶的捕獲、當DNA被牽拉出所述納米孔時電流的逐步變化。圖3顯示了解旋酶控制DNA運動事件的另一個例子。下部)為，所述事件的一部分的放大圖，示出了當DNA鏈不同部分移動穿過納米孔時電流的逐步變化。圖4顯示了解旋酶至少以兩種操作模式控制DNA的移動。解旋酶沿著DNA的5’到3’的方向運動，而DNA在納米孔中的定向(取決于該DNA的哪一端被捕獲)是指，所述酶能用于將DNA逆著施加的電場移出所述納米孔，或者將DNA順著該施加的電場移入所述納米孔。左圖)為，當DNA的3’端被捕獲時，解旋酶逆著電壓所施加的電場的方向起作用，將螺旋狀DNA牽拉出納米孔，并進入順式隔室中。右圖)為，當DNA的5’端(5’-down)向下被捕獲到納米孔中時，解旋酶沿著電場的方向將DNA移動到納米孔中，并進入到雙分子層的反側。圖5顯示了測試酶活性的熒光試驗。A)使用常規的熒光底物來檢測解旋酶用于置換(displace)雜交的雙鏈DNA的能力。1)熒光底物鏈(50nM終濃度)具有5’單鏈DNA懸突，以及雜交的雙鏈DNA的40個堿基部分。主鏈上部(majorupperstrand)在3’末端具有羧基熒光素堿基，并且所述雜交的互補鏈在5’末端具有黑洞淬滅劑(black-holequencher(BHQ-1))堿基。當雜交時，熒光素的熒光被局部的BHQ-1淬滅，并且底物基本上是無熒光的。該試驗中包括與熒光底物的較短鏈互補的1μM捕獲鏈。2)在ATP(1mM)和MgCl2(10mM)的存在下，添加到底物的解旋酶(150nM)結合至熒光底物的5′尾部，沿著主鏈移動，并如所示置換互補鏈。3)具有BHQ-1的互補鏈完全被置換，主鏈上熒光素發熒光。4)過量的捕獲鏈優選與互補鏈DNA退火以防止初始底物重新退火并防止丟失熒光。B)顯示了在含有100mM至2M的不同濃度的KCl的緩沖溶液(100mMHepespH8.0,1mMATP,10mMMgCl2,50nM熒光底物DNA,1μM捕獲DNA)中的MbuXPD解旋酶活性的初始速率的圖。圖6為實施例1中所用的墊片(spacer)iSp18的結構。序列表的說明SEQIDNO:1示出了密碼子優化的、編碼MS-B1突變MspA單體的多核苷酸序列。該突變缺少信號序列并包括下列突變:D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。SEQIDNO:2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種表征目標多核苷酸的方法，包括：(a)使目標多核苷酸與跨膜孔及XPD解旋酶接觸，使得目標多核苷酸移動穿過所述跨膜孔，并使XPD解旋酶控制目標多核苷酸穿過所述跨膜孔的移動；和(b)當所述目標多核苷酸相對于所述跨膜孔移動時，獲取一個或多個測量值，其中所述測量值代表所述目標多核苷酸的一個或多個特征并由此表征所述目標多核苷酸。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.12.29 US 61/581,3401.一種表征目標多核苷酸的方法，包括：(a)使目標多核苷酸與跨膜孔及XPD解旋酶接觸，使得目標多核苷酸移動穿過所述跨膜孔，并使XPD解旋酶控制目標多核苷酸穿過所述跨膜孔的移動；和(b)當所述目標多核苷酸相對于所述跨膜孔移動時，獲取一個或多個電流測量值，其中所述電流測量值代表所述目標多核苷酸的一個或多個特征并由此表征所述目標多核苷酸。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述一個或多個特征選自(i)目標多核苷酸的長度，(ii)目標多核苷酸的同一性，(iii)目標多核苷酸的序列，(iv)目標多核苷酸的二級結構，和(v)目標多核苷酸是否被修飾。3.根據權利要求2所述的方法，其中對所述目標多核苷酸用一個或多個蛋白質或一個或多個標記物、標簽或間隔物通過甲基化、氧化進行了修飾。4.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(b)包括當所述目標多核苷酸移動穿過所述跨膜孔時獲取一個或多個測量值。5.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法還包括跨所述跨膜孔施加電壓以在所述跨膜孔和所述解旋酶之間形成復合體的步驟。6.根據權利要求1所述的方法，其中至少所述目標多核苷酸的一部分是雙鏈的。7.根據權利要求1所述的方法，其中所述跨膜孔為跨膜蛋白孔或固態孔。8.根據權利要求7所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔選自溶血素、殺白細胞素、恥垢分枝桿菌膜孔蛋白A(MspA)、外膜蛋白F(OmpF)、外膜蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A、奈瑟氏菌自轉運脂蛋白(NalP)和WZA。9.根據權利要求1所述的方法，其中所述XPD解旋酶的氨基酸模序為：(a)YLWGTLSEG(SEQIDNO:11)和/或QAMGRVVRSPTDYGARILLDGR(SEQIDNO:12)；(b)SLWGTLAEG(SEQIDNO:14)和/或QAIGRVVRGPDDFGVRILADRR(SEQIDNO:15)；(c)YLWGTLSEG(SEQIDNO:11)和/或QAMGRVVRSPGDFGVRILLDAR(SEQIDNO:17)；(d)YLWGTLSEG(SEQIDNO:11)和/或QAMGRVVRSPSDYGARILLDGR(SEQIDNO:19)；(e)SLWGTLAEG(SEQIDNO:14)和/或QALGRVVRSPTDFGVRVLVDER(SEQIDNO:21)；(f)VTGGVFAEG(SEQIDNO:23)和/或QAAGRVLRTPEDRGVIALLGRR(SEQIDNO:24)；(g)LGTGAFWEG(SEQIDNO:26)和/或QGVGRLIRDERDRGVLILCDNR(SEQIDNO:27)；(h)YIWGTLSEG(SEQIDNO:29)和/或QAMGRVVRSPTDYGARILIDGR(SEQIDNO:30)；(i)YLWGTLSEG(SEQIDNO:11)和/或QAMGRIVRSPDDYGVRILLDSR(SEQIDNO:32)；(j)SLWGTLAEG(SEQIDNO:14)和/或QALGRVIRAPDDFGVRVLADKR(SEQIDNO:34)；(k)VSGGRLSEG(SEQIDNO:36)和/或QEIGRLIRSAEDTGACVILDKR(SEQIDNO:37)；(l)VMGGRNSEG(SEQIDNO:39)和/或QAAGRVHRSEEEKGAVVVLDYR(SEQIDNO:40)；(m)VMGGRNSEG(SEQIDNO:39)和/或QAAGRVHRSEEEKGSIVILDYR(SEQIDNO:42)；(n)SLWGTLAEG(SEQIDNO:14)和/或QAMGRVIRSPEDFGVRMLVDRR(SEQIDNO:45)；(o)L...

【專利技術屬性】
技術研發人員：露絲·莫伊西，安德魯·約翰·赫倫，紹博爾奇·蘇羅爾斯，
申請(專利權)人：牛津納米孔技術公司，
類型：發明
國別省市：英國;GB