一種檢測(cè)受實(shí)驗(yàn)者體液體外促進(jìn)疾病相關(guān)蛋白聚合能力的方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種檢測(cè)α-突觸核蛋白在血漿中的寡聚體形成率的方法，該方法包括將純化的重組人α-突觸核蛋白與血漿在一定溫度下振蕩孵育使其聚合成寡聚體，用ELISA方法測(cè)定α-突觸核蛋白寡聚體含量，通過(guò)寡聚體占總α-突觸核蛋白含量的比率計(jì)算獲得α-突觸核蛋白在血漿中的寡聚體形成率。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

:本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種檢測(cè)α-突觸核蛋白在血漿中的寡聚體形成率的方法，該方法可用于帕金森病的診斷。
技術(shù)介紹
:帕金森病是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為靜止振顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵直和姿勢(shì)不穩(wěn)定等運(yùn)動(dòng)癥狀[1’2]。引起這些癥狀的原因是中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元大量死亡和由此引起的紋狀體部位的多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的大幅度減少。帕金森病的主要病理特征是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體一路易體(Lewy body)和路易神經(jīng)索(Lewy neurite)。構(gòu)成路易體和路易神經(jīng)索的主要成分是纖維化的α-突觸核蛋白(α-synuclein) [3]。大量研究表明，a -突觸核蛋白是在帕金森病的發(fā)病中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。a-突觸核蛋白基因點(diǎn)突變和多倍體變異可以引起家族性早發(fā)性帕金森病，其基因啟動(dòng)子多態(tài)性與帕金森病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[4_6]。已經(jīng)證明，帕金森病人腦組織中的α-突觸核蛋白存在改變，表現(xiàn)為該蛋白的表達(dá)量異常增高，磷酸化、硝基化、泛素化和糖基化的修飾體增加[7_9]。這些異常表達(dá)和修飾的α-突觸核蛋白是引起該蛋白聚集成寡聚體的原因并進(jìn)而形成纖維而沉積在路易體中。大量證據(jù)表明，異常表達(dá)、修飾和聚集的α-突觸核蛋白對(duì)神經(jīng)元具有毒性作用，是各種原因?qū)е律窠?jīng)元退變和帕金森病的關(guān)鍵[1°_13]。通過(guò)對(duì)帕金森病人組織的病理檢查證明，路易體在病人的組織中廣泛分布，除中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛區(qū)域外，還包括分布于各外周器官的神經(jīng)組織，如消化道、膀胱、心臟、唾液腺等，并且認(rèn)為消化道的路易體病變甚至早于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[14]。這些結(jié)果提示，帕金森病很可能是機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變引起的一種全身性代謝性紊亂疾病，血液作為機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，很可能發(fā)生某種改變，從而有利于α-突觸核蛋白的聚集。這可能是以聚集的α-突觸核蛋白為主要成分的路易體的廣泛存在的重要原因。因此，檢測(cè)血漿促進(jìn)α-突觸核蛋白形成能力或α-突觸核蛋白在血漿中的寡聚體形成率有助于了解α-突觸核蛋白在帕金森病人神經(jīng)組織易于聚集的機(jī)體內(nèi)在環(huán)境因素的改變。現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)血液中α-突觸核蛋白及其寡聚體的檢測(cè)主要是對(duì)其含量的直接測(cè)定。所使用的方法主要是利用ELISA方法直接檢測(cè)血漿或血清中α-突觸核蛋白及寡聚體含量，尚未有關(guān)于檢測(cè)血漿中a -突觸核蛋白寡聚體形成率的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。上述方法存在以下缺陷:對(duì)血漿和血清中的a -突觸核蛋白及其寡聚體含量的測(cè)定結(jié)果極其不穩(wěn)定，不同文獻(xiàn)報(bào)道的正常值相差近1000倍，對(duì)病人血漿中的α-突觸核蛋白及其寡聚體含量測(cè)定未能得出一致結(jié)論。例如，F(xiàn)oulds PG等人的一項(xiàng)研究檢測(cè)到帕金森病人血漿中α-突觸核蛋白含量較正常對(duì)照升高[15]，而Li QX等人的研究則發(fā)現(xiàn)帕金森病人血漿中a -突觸核蛋白含量低于正常對(duì)照[16]。El-Agnaf等人的研究發(fā)現(xiàn)血漿中α-突觸核蛋白寡聚體高于正常對(duì)照[17]，而Foulds PG等人的一項(xiàng)研究檢測(cè)到帕金森病人血漿中α-突觸核蛋白寡聚體含量低于正常對(duì)照[18]。這樣相互矛盾的結(jié)果可能是由于血漿中α -突觸核蛋白及其寡聚體本身含量較低，不同實(shí)驗(yàn)室所建立的ELISA方法的靈敏度之間存在差異以及樣本溶血所造成的。因此，二者(上述方法)是否可作為帕金森病診斷標(biāo)記物尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。為克服上述缺陷，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種檢測(cè)α-突觸核蛋白在血漿中的寡聚體形成率的檢測(cè)方法，該方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可以顯著區(qū)分帕金森病人和正常健康人的血漿促進(jìn)α -突觸核蛋白寡聚體的形成能力，是篩選帕金森病高危人群和臨床診斷帕金森病的重要手段。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
:本專(zhuān)利技術(shù)提供一種檢測(cè)α -突觸核蛋白在血漿中的寡聚體形成率的檢測(cè)方法，該方法可以用于測(cè)試血漿促進(jìn)α-突觸核蛋白寡聚體的形成能力。本專(zhuān)利技術(shù)將純化的重組人α -突觸核蛋白與血漿(人或動(dòng)物)在一定溫度下進(jìn)行振蕩孵育，使其聚合，然后利用識(shí)別人α-突觸核蛋白同一抗原表位的單克隆抗體分別作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體，利用抗原-抗體反應(yīng)原理檢測(cè)α-突觸核蛋白在病人和正常健康人血漿中的寡聚體含量，并計(jì)算α -突觸核蛋白寡聚體的形成率。本專(zhuān)利技術(shù)的寡聚體形成率的檢測(cè)方法包括以下步驟和內(nèi)容:I)分離血漿；2)加入重組人α -突觸核蛋白，得到寡聚體；3)抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體和寡聚體反應(yīng)，隨后加入堿性磷酸酶和顯色齊U，進(jìn)行顯色；4)用分光光度法對(duì)顯色的樣品進(jìn)行吸光度測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中寡聚體的形成率。以下對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)所用名稱(chēng)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行解釋:重組人α -突觸核蛋白:將攜帶人α -突觸核蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌，培養(yǎng)、提取并純化獲得的帕金森病相關(guān)蛋白。血漿中人α -突觸核蛋白寡聚體:血漿中存在的聚合形式的α -突觸核蛋白，是其主要毒性形式。抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體:本專(zhuān)利技術(shù)的抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體命名為1Β2抗體，用于識(shí)別α-突觸核蛋白的特異氨基酸序列的鼠抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體，可與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的α-突觸核蛋白發(fā)生反應(yīng)。堿性磷酸酶:在ELISA測(cè)定中，堿性磷酸酶的色原底物是對(duì)硝基苯磷酸鹽(p-nitropheny-phosate,pNPP)。pNPP在堿性磷酸酶的作用下生成對(duì)硝基酹(ρΝΡ),其在λ=405nm處有最大吸收。親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶:將堿性磷酸酶進(jìn)行親和素標(biāo)記，親和素可與生物素結(jié)合，起級(jí)聯(lián)放大作用。顯色劑:硝基苯磷酸單鈉鹽，可簡(jiǎn)稱(chēng)為pNPP單鈉。與pNPP —樣，用于ELISA的化學(xué)顯色底物。堿性磷酸酶和PNPP反應(yīng)后，形成黃色水溶反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物在405nm處有光吸光。ELISA 酶標(biāo)板:在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked ImmunosorbantAssay, ELISA)中，作為載體的固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面對(duì)抗原、抗體或抗原抗體復(fù)合物的吸附起重要作用。抗原、抗體和其它生物分子通過(guò)多種機(jī)制吸附至載體表面，這包括通過(guò)疏水鍵、流水/離子鍵的被動(dòng)吸附，通過(guò)引入其它活性基團(tuán)如氨基和碳基的共價(jià)結(jié)合，以及通過(guò)表面改性后的親水鍵結(jié)合。PBS:憐酸緩沖液(phosphate buffered saline),濃度為 0.01mol/L。NaHCO3緩沖液:碳酸氫鈉緩沖液,濃度為200mmol/L，pH9.6。封閉液:明膠含量為2.5%的PBST溶液，作用為封閉非特異結(jié)合，降低ELISA背旦-5^ OPBST:在0.01mol/L PBS中含有0.05% Tween-20即為磷酸鹽吐溫緩沖液，PBST。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法如下:每次試驗(yàn)時(shí)將α-突觸核蛋白進(jìn)行系列稀釋?zhuān)K濃度分別為0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125、0 μ mol/L，與樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，讀取相對(duì)應(yīng)405nm處吸光值，做出其與濃度之間的關(guān)系曲線。本專(zhuān)利技術(shù)所述抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體屬于全新的概念，為此，本專(zhuān)利技術(shù)還提供抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體作為本專(zhuān)利技術(shù)的一部分。本專(zhuān)利技術(shù)提供抗體抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體，其制備方法如下:步驟1，重組蛋白抗原的制備:制備并純化人全長(zhǎng)α -突觸核蛋白作為抗原。步驟2，免疫小鼠:使用福氏完全佐劑(第一次免疫)與福氏不完全佐劑(隨后的免疫)乳化重組人α-突觸核蛋白，每隔2周對(duì)BALB/c雌性小鼠進(jìn)行免疫(50 μ g抗原/次/小鼠)。抽取動(dòng)物血清，利用E本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)α?突觸核蛋白在血漿中的寡聚體形成率的試劑盒，試劑盒中包括以下試劑：重組人α?突觸核蛋白，抗人α?突觸核蛋白單克隆抗體1B2。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)α-突觸核蛋白在血漿中的寡聚體形成率的試劑盒，試劑盒中包括以下試劑:重組人α-突觸核蛋白，抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體1Β2。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，試劑盒中還包括生物素化的抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體1Β2。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，根據(jù)需要，所述試劑盒還可包括以下輔助試劑: 堿性磷酸酶，或親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶 對(duì)硝基酚磷酸顯色液 ELISA酶標(biāo)板 磷酸鹽緩沖液 NaHCO3緩沖液 封閉液 PBST。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中 磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01mol/L, NaHCO3 緩沖 液的濃度為 200mmol/L，pH9.6， 封閉液的濃度為2.5%，PBST 為含 0.05% Tween-20 的 0.01M PBS。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中各試劑分別包裝，每個(gè)包裝裝入試劑的量以夠一個(gè)樣本使用量為基本量，可以擴(kuò)大到10個(gè)，100個(gè)，1000個(gè)樣本的使用量。6.抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體1B2，其制備方法如下: 步驟1，重組蛋白抗原的制備:制備并純化人全長(zhǎng)α-突觸核蛋白作為抗原， 步驟2，免疫小鼠:使用福氏完全佐劑進(jìn)行第一次免疫，用福氏不完全佐劑進(jìn)行隨后的免疫，乳化重組人α -突觸核蛋白，每隔2周對(duì)BALB/c雌性小鼠進(jìn)行免疫，50 μ g抗原/次/小鼠，抽取動(dòng)物血清，利用ELISA與Western blot方法檢測(cè)其效價(jià)與特異性， 步驟3，篩選雜交瘤細(xì)胞株:選取血清效價(jià)高的小鼠，取出其脾細(xì)胞，在存在聚乙二醇4000的條件下與小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2融合，隨后使用HAT培養(yǎng)基對(duì)融合的產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行選擇培養(yǎng)，最后用ELISA方法篩選可以產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，ELISA篩選陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)一步利用免疫組化與免疫印跡法鑒定所篩選雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體的特異性，經(jīng)篩選，克隆號(hào)為1B2的雜交瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生特異性抗人α-突觸核蛋白抗體，1Β2的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)2次亞克隆進(jìn)行純化后，在冷凍保護(hù)液的保護(hù)下與液氮中長(zhǎng)期保存，步驟4 ;抗體制備:將1Β2雜交瘤細(xì)胞從液氮中復(fù)蘇，并用雜交瘤培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中大量擴(kuò)增，收獲細(xì)胞，將細(xì)胞由腹膜內(nèi)注射入BALB/c裸鼠體內(nèi)，產(chǎn)生腹水，收獲腹水，利用protein A親和層析純化法獲得純化的1B2鼠抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體，定量、分裝、保存。7.生物素化的抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體1Β2，其制備方法如下: 步驟1，用無(wú)水DMSO配制10mg/ml生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液，步驟2，用0.lmol/L, pH8.8硼酸鹽緩沖液配制濃度為I~3mg/ml的抗體1B2溶液，若抗體1B2儲(chǔ)存時(shí)加入了疊氮鈉，則標(biāo)記前須先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉，步驟3，按25~100 μ g/mg的比率將生物素酯加入抗體1B2中，混合均勻并在室溫下孵育4h， 步驟4，每250 μ g生物素酯內(nèi)加入20 μ I lmol/L的氯化銨，室溫孵育lOmin， 步驟5，將抗體1B2溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素， 步驟6，按純化抗體的儲(chǔ)存方法保...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：于順，尹娜，楊巍巍，李昕，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11