一種與SNAP基序和CLIP標記物特異性結合的單克隆抗體，包含具有氨基酸序列SEQ?ID?No.3,4,5和8,9,10的CDR。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于檢測SNAP/CLIP標記物的單克隆抗體本專利技術涉及用于檢測SNAP/CLIP標記物的單克隆抗體,編碼該抗體的核酸和該抗體用于檢測含有SNAP/CLIP標記物的蛋白的用途。SNAP和CLIP標記技術是一種相對年輕的技術。它是給靶蛋白，特別是融合蛋白提供所需配體的精細方法。WO20009/114748A1披露了SNAP-25組合物，制造α-SNAP-25抗體的方法，α-SNAP-25抗體，檢測BoNT/A活性的方法和檢測中和α-BoNT/A抗體的方法，所述α-SNAP-25抗體與某種表位結合，而所述表位包含SNAP-25切割產物的BoNT/A切割位點易切斷鍵的P1殘基處的羧基末端。M.Yamamoto,L.Hassinger,J.E.Crandall在JournalofNeurocytology19,619-627(1990)報道了階段特異性神經突相關蛋白在發育中大鼠大腦和小腦皮質中的超微結構定位。SNAP/TAG-1是135kDa的糖蛋白，在發育的嚙齒動物CNS中生長軸突子集的表面表達。采用免疫電子顯微術和識別SNAP/TAG-1(4D7)的單克隆抗體以及過氧化物酶偶聯的二抗，分析了大鼠的胚胎期第17天大腦皮層和出生后第4天和第8天小腦皮層中這種抗原的超微結構定位。在胚胎皮層，免疫反應性與位于中間區(intermediatezone)，基底板(subplate)和皮質板(corticalplate)的有限組的神經軸突的質膜，神經元胞體(neuronalsomata)以及它們的主導過程相關。免疫反應性軸突結合在一起成為10-20個的一組，并與非免疫反應性軸突隔開。有些生長錐呈免疫反應性，然而不是所有4D7-免疫反應性軸突的生長錐顯示染色。在出生后的小腦中，免疫反應活性與位于外部顆粒細胞層(externalgranulecelllayer)的最內部分的顆粒細胞的胞體和軸突相關。在大腦和小腦皮層，免疫反應活性以間插方式出現在相鄰細胞膜的對應點，規律性的周期為100-200nm。該文獻討論了SNAP/TAG-1用作發育CNS中特定亞組軸突的粘附分子的可能性。RichardJWard,JohnDPediani,和GraemeMilligan在BritishJournalPharmacology(2011),162,1439-1452中報道了通過N-端SNAP和CLIP-標記技術評估配體誘導的食欲肽OX1和大麻素CB1受體的內在化。通過抗體識別表位標簽和熒光團與O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶變體的共價結合檢測每一種受體結構的細胞表面形態。可采用各方法監測對激動劑而非拮抗劑作起反應的受體內在化，但當使用SNAP標記物的新型、時間分辨熒光探針時，靈敏度最高是其它方法的6-10倍以上。然而，就CLIP標記物而言，靈敏度沒有提高，可能由于非特異性結合水平較高。SNAP標記物基于人DNA修復酶O(6)-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶。后者已通過引入突變而得到改變，其改變程度使得可以選出具有更小分子體積并對芐基鳥嘌呤具有極高親和力的蛋白變體。SNAP標記物與芐基鳥嘌呤衍生物高度特異性反應，使芐基與和自身共價偶聯的底物結合并切除鳥嘌呤。作為一種重組蛋白標記物，它能共價和化學計量地限定各種芐基鳥嘌呤修飾底物與融合蛋白的偶聯。CLIP標記物是通過誘變從SNAP形成，其與芐基胞嘧啶衍生物而非芐基鳥嘌呤發生高度特異性反應。因此，可能在一個實驗方法中同時差別性標記SNAP和CLIP標記物。SNAP技術(SNAP/CLIP質粒和底物)由新英格蘭生物試驗室公司(NEB)分銷。在"JournalofBiomedicineandBiotechnology",Vol.2010的ID658954,doi:10.1155/2010/658954的文章中Aliprandi等人披露了一種以VHH形式的重組抗SNAP的抗體。有一種能同時檢測CLIP和SNAP標記物的分析工具是最好了。本專利技術的目的通過權利要求1所述的抗體得以實現。本專利技術的單克隆抗體特異性地結合SNAP標記物基序和CLIP標記物并包含具有氨基酸序列SEQIDNo.3,4,5和8,9,10的CDR。特別是，本專利技術的抗體是鼠科抗體。本專利技術的主題也是編碼本專利技術抗體的核酸，特別是具有SEQIDNo.1或6所示核酸序列的核酸。本專利技術抗體可通過本專利技術方法獲得，其中借助SNAP標記物蛋白在非人類哺乳動物，特別是小鼠中實施免疫，以及從中獲得雜交瘤細胞，通過結合試驗鑒定同時識別SNAP和CLIP標記物的抗體細胞系。本專利技術抗體同時檢測SNAP和CLIP標記物的用途。Aliprandi等描述了能識別SNAP標記物的重組抗體。本專利技術的抗體可以用于染色組織切片。本專利技術的鼠科抗-SNAP抗體可以用于，特別是染色冷凍切片和石蠟切片。與Aliprandi等人已經發表過的抗體相比，本專利技術抗體的優越性在于其更高的價位，重組蛋白只能識別一個表位，而本專利技術抗體能識別兩個表位。圖1：免疫組織化學；用HAI(抗-EGFR)和M2D11染色從小鼠獲得的A431腫瘤冷凍切片。圖2：流式細胞術；圖片顯示在流式細胞術中M2D11和兩種不同的SNAP融合蛋白結合。圖3：Westernblot分析：兩個圖片顯示，一方面在變性凝膠中M2D11與SNAP和CLIP-EGF兩種蛋白結合。圖4：Westernblot分析；此圖片顯示檢測溶液中M2D11和SNAP蛋白結合的天然聚丙烯酰胺凝膠印跡。本專利技術的抗體能同時檢測SNAP標記物和CLIP標記物。本專利技術的抗體的優勢在于可以在流式細胞術中檢測SNAP融合蛋白。該抗體在ELISA(酶聯免疫吸附測定)和Westernblot中的靈敏度與Aliprandi等人描述的抗體相似。除了描述的方法，免疫組織化學試驗中測驗本專利技術抗體。它可以用于檢測冷凍切片和石蠟切片中的SNAP融合蛋白。在特定的實施例中，抗體是單克隆抗體。特別是，抗體可以是鼠源的。鼠科抗體有優越性的原因在于鼠科IgG抗體屬于分子生物學研究中最常用的抗體形式。因此，很多實驗室的技術人員熟悉使用這類抗體和檢測鼠科IgG抗體。本專利技術抗體的重鏈可變區示于SEQIDNo.2，SEQIDNo.1涉及編碼該區的核酸。本專利技術抗體的輕鏈可變區示于SEQIDNo.7，SEQIDNo.6涉及編碼該區的核酸。本專利技術抗體重鏈的CDR見氨基酸序列SEQIDNo.3-5。本專利技術抗體輕鏈的CDR見氨基酸序列SEQIDNo.8-10。本專利技術也涉及編碼所述蛋白的核酸，尤其是SEQIDNo.1和6。本專利技術還涉及制備本專利技術抗體的方法，其中借助SNAP標記物蛋白在非人類哺乳動物，特別是小鼠中實施免疫。從中獲得雜交瘤細胞系以及通過相應的結合試驗鑒定能同時識別SNAP和CLIP標記物的抗體細胞系。本專利技術的抗體可以分別用于檢測SNAP和CLIP標記物，也可以是二者的組合。實施例聚丙烯酰胺凝膠電泳和Westernblot在Laemmli緩沖液中使待分析的樣本變性(或在不含SDS的天然樣本緩沖液中)并在12％(w/v)SDS的聚丙烯酰胺凝膠和聚丙烯酰胺凝膠(160V,60min)上進行電泳。蛋白用考馬斯染色法顯色或轉移到硝酸纖維素膜(Whatman,Schleicher&Schu本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種與SNAP標記物基序和CLIP標記物特異性結合的單克隆抗體，所述單克隆抗體包含具有氨基酸序列SEQ?ID?No.3,4,5和8,9,10的CDR。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.11.25 EP 11190787.91.一種與SNAP標記物基序和CLIP標記物特異性結合的單克隆抗體，所述單克隆抗體包含CDR，且所述CDR的氨基酸序列如SEQIDNo.3,4,5和8,9,10所示。2.如權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體是鼠科抗體。3.一種編碼抗體的核酸，其特征在于，所述核酸是編碼具有重鏈CDR的抗體的核酸和編碼具有輕鏈CDR的抗體的核酸，其中，所述重鏈CDR的氨基酸序列如SEQIDNo.3，4和5所示，所述輕鏈CDR的氨基酸序列...
【專利技術屬性】
技術研發人員：S·巴思，K·科爾伯格，C·帕特曼，S·施密斯，
申請(專利權)人：德國弗勞恩霍夫協會債權安格萬特學術研究所，
類型：發明
國別省市：德國;DE
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