豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及制備方法技術

本發明專利技術公開了一種豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及制備方法。該試紙包括樣品吸收區、金標探針區、固相化抗原和抗體區、吸水區和支撐板，樣品吸收區、金標探針區、固相化抗原抗體區和吸水區鋪設在支撐板上并依次相互部分重疊；金標探針區包被金標探針，為膠體金標記的小鼠抗豬IgG抗體；固相化抗原和抗體區依次有檢測線T1包被豬偽狂犬病毒gE蛋白、檢測線T2包被豬偽狂犬病毒gB蛋白、檢測線T3包被豬偽狂犬病毒gD蛋白和對照線C包被羊抗小鼠IgG抗體。本發明專利技術的試紙檢測快速，準確率高，特異性強，攜帶、操作簡便，可同時用于PRV野毒感染及疫苗免疫的鑒別診斷和PRV疫苗免疫效果的評估。

【技術實現步驟摘要】

????本專利技術涉及一種檢測試紙及制備方法，具體涉及一種豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙及制備方法。
技術介紹
偽狂犬病（Pseudorabies）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies?virus，PRV）引起的包括多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。豬是偽狂犬病最主要的貯存宿主和傳染源。健康豬與病豬、帶毒豬直接接觸可感染本病。成年豬常為隱性感染；受感染的懷孕母豬則出現流產、死胎、弱胎和木乃伊胎等病征；受感染的新生仔豬出現發熱及神經癥狀，甚至衰竭死亡，死亡率可達100%。自1902年首次在美國發現偽狂犬病以來，該病己在全球范圍內流行。我國自1947年首次發現偽狂犬病以來，至2006年已有31個省（區）、市有關于偽狂犬病的報道。偽狂犬病對我國乃至全球養豬業的健康發展造成了巨大的經濟損失，成為嚴重危害養豬業健康發展的重大傳染病之一。在PRV與宿主的相互作用中，病毒的gB和gD囊膜糖蛋白起著重要作用。病毒囊膜糖蛋白gB和gD不僅介導病毒對靶細胞的感染，也是被感染的宿主免疫系統識別的主要抗原。在皰疹病毒中gB蛋白屬于最保守的糖蛋白之一，該糖蛋白能誘導機體產生高滴度的中和抗體，且是病毒感染過程中的必須成分。PRV?gD為病毒感染必需的結構蛋白，該蛋白參與病毒的穿透過程，是一種重要的中和抗原，也是保護性抗體的主要目標。研究表明，gD基因是預防豬偽狂犬病重組腺病毒疫苗和核酸疫苗的重要靶序列，可以作為血清學診斷抗原。gE糖蛋白是PRV的一種十分重要的糖蛋白，在決定病毒的毒力及神經嗜性等方面起著重要作用，但gE不是PRV增殖所必需的蛋白，常作為缺失的候選基因。目前，常用的檢測PRV的方法包括乳膠凝集（LAT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、聚合酶鏈反應（PCR）等。膠體金免疫層析法作為一種日漸成熟的實驗檢測方法，以其特異性強、成本低，操作簡便，結果可靠、可單份或成批測定、不需任何儀器等優點已被廣泛接受。目前已有報道的PRV檢測試紙多只能檢測針對單一蛋白抗原（gE）的抗體，測試者往往需要借助二次檢測才能進一步確定在沒有野毒感染的情況下，是否存在PRV抗體。?
技術實現思路
本專利技術的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙。該試紙采用膠體金標記的小鼠抗豬IgG單抗做探針，包被豬偽狂犬病毒gE、gB和gD蛋白抗原和羊抗小鼠IgG抗體進行抗豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的檢測。本專利技術的另一目的在于提供上述豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙的制備方法。本專利技術的再一目的在于提供上述豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙的使用方法。本專利技術的目的通過下述技術方案實現：一種豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙，包括樣品吸收區、金標探針區、固相化抗原和抗體區、吸水區和支撐板，樣品吸收區、金標探針區、固相化抗原抗體區和吸水區鋪設在支撐板上并依次相互部分重疊；所述的金標探針區包被金標探針，為膠體金標記的小鼠抗豬IgG單抗，標記量優選為每mL膠體金標記5～20μg小鼠抗豬IgG單抗，金標探針包被量優選為5～10μL；所述的固相化抗原和抗體區（自金標探針區至吸水區方向）依次有檢測線T1、T2、T3和對照線C；所述的檢測線T1包被有豬偽狂犬病毒gE蛋白，包被量優選為0.5～5μg；檢測線T2包被有豬偽狂犬病毒gB蛋白，包被量優選為0.5～5μg；檢測線T3包被有豬偽狂犬病毒gD蛋白，包被量優選為0.5～5μg；對照線C包被有羊抗小鼠IgG抗體，包被量優選為為1～10μg。所述的支撐板的材料優選為粘有一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板；所述的樣品吸收區的材料優選為玻璃纖維膜；所述的金標探針區的材料優選為聚酯膜；所述的固相化抗原和抗體區的材料優選為硝酸纖維素膜；所述的吸水區的材料優選為吸水濾紙。所述的豬偽狂犬病毒gE、gB和gD蛋白抗原可按照常規的基因工程方法進行制備或表達，這些都是本領域技術人員所能掌握或通曉的。上述豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙的制備方法，包括如下步驟：將膠體金標記的小鼠抗豬IgG單抗噴涂于聚酯膜上；在硝酸纖維素膜上依次包被檢測線T1（包被豬偽狂犬病毒gE蛋白）、T2（包被豬偽狂犬病毒gB蛋白）、T3（包被豬偽狂犬病毒gD蛋白）和對照線C（包被羊抗小鼠IgG抗體）；將玻璃纖維膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝到支撐板上得到豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙。更優選的，所述的豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙的制備方法包括如下步驟：（1）膠體金標記小鼠抗豬IgG單抗的方法：分別取半徑為10～40nm濃度為0.01%的膠體金20mL及小鼠抗豬IgG單抗100～400μg，在pH值8.5～9.2的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作為穩定劑，且使得BSA最終質量濃度為0.1～5%，PEG20000最終質量濃度為0.01～0.1%，采用離心法除去未結合的小鼠抗豬IgG單抗和未穩定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金－小鼠抗豬IgG單抗復合物。（2）將膠體金標記的小鼠抗豬IgG單抗噴涂于聚酯膜上：用20mL含1%BSA的PBS（0.01M，pH值7.4）分別洗滌膠體金－小鼠抗豬IgG單抗復合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2mL含1%BSA的PBS溶解，用噴涂設備涂于聚酯膜上，凍干。（3）硝酸纖維素膜的包被：在硝酸纖維素膜依次包被檢測線T1、T2、T3和對照線C；檢測線T1包被豬偽狂犬病毒gE蛋白的量為0.5～5μg；檢測線T2包被豬偽狂犬病毒gB蛋白的量為0.5～5μg；檢測線T3包被豬偽狂犬病毒gD蛋白的量為0.5～5μg；對照線C包被羊抗小鼠IgG抗體的量為1～10μg；每條線寬1～3mm。（4）試紙組裝：用粘上一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板作為支撐載體，上面依次鋪設玻璃纖維膜、金標探針的聚酯膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙，外面用膠帶包封制成。除非另有說明，本專利技術涉及液體與液體之間的百分比時，所述的百分比為體積/體積百分比；本專利技術涉及液體與固體之間的百分比時，所述百分比為體積/重量（mL/g）百分比；本專利技術涉及固體與液體之間的百分比時，所述百分比為重量/體積（g/mL）百分比；其余為重量/重量百分比。上述豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙的使用方法，包括如下步驟：將該試紙的樣品吸收區一端浸入待檢血清樣品中，5～10分鐘后判讀結果：對照線C出現紅色，表示試紙有效；檢測線T1、T2、T3出現紅色，分別表明偽狂犬病毒gE、gB、gD抗體陽性；檢測線T1、T2、T3無顏色出現，表明血清中沒有對應的偽狂犬病毒gE、gB、gD抗體或抗體量很低。本專利技術相對于現有技術具有如下優點和效果：（1）檢測快速：檢測時間本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：包括樣品吸收區、金標探針區、固相化抗原和抗體區、吸水區和支撐板，樣品吸收區、金標探針區、固相化抗原抗體區和吸水區鋪設在支撐板上并依次相互部分重疊；所述的金標探針區包被金標探針，為膠體金標記的小鼠抗豬IgG單抗；所述的固相化抗原和抗體區有包被豬偽狂犬病毒gE蛋白的檢測線T1、包被豬偽狂犬病毒gB蛋白的檢測線T2、包被豬偽狂犬病毒gD蛋白的檢測線T3和包被羊抗小鼠IgG抗體的對照線C。

【技術特征摘要】
1.一種豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：包括樣品吸收區、金標探針區、固相化抗原和抗體區、吸水區和支撐板，樣品吸收區、金標探針區、固相化抗原抗體區和吸水區鋪設在支撐板上并依次相互部分重疊；所述的金標探針區包被金標探針，為膠體金標記的小鼠抗豬IgG單抗；所述的固相化抗原和抗體區有包被豬偽狂犬病毒gE蛋白的檢測線T1、包被豬偽狂犬病毒gB蛋白的檢測線T2、包被豬偽狂犬病毒gD蛋白的檢測線T3和包被羊抗小鼠IgG抗體的對照線C。
2.根據權利要求1所述的豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：所述的支撐板的材料為粘有一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板；所述的樣品吸收區的材料為玻璃纖維膜；所述的金標探針區的材料為聚酯膜；所述的固相化抗原和抗體區的材料為硝酸纖維素膜；所述的吸水區的材料為吸水濾紙。
3.根據權利要求1所述的豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：所述的金標探針的標記量為每mL膠體金標記5～20μg小鼠抗豬IgG單抗，金標探針的包被量為5～10μL；所述的檢測線T1包被豬偽狂犬病毒gE蛋白的量為0.5～5μg，檢測線T2包被豬偽狂犬病毒gB蛋白的量為0.5～5μg，檢測線T3包被豬偽狂犬病毒gD蛋白的量為0.5～5μg，對照線C包被羊抗小鼠IgG抗體的量為1～10μg。
4.權利要求1-3任一項所述的膠體金免疫層析檢測試紙的制備方法，其特征在于包括如下步驟：將膠體金標記的小鼠抗豬IgG單抗噴涂于聚酯膜上；在硝酸纖維素膜上包被檢測線T1、T2、T3和對照線C；將玻璃纖維膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝到支撐板上得到豬偽狂犬病毒gE、gB和gD抗體的膠體金免疫層析檢測試紙。
5.根據權利要求4所述的膠體金免疫層析檢測試紙的制備方法，其特征在于包括如下...

【專利技術屬性】
技術研發人員：廖園園，漆世華，秦偉，朱薇，劉潔，孫慶歌，鄭良益，謝紅玲，溫文生，馮釗，
申請(專利權)人：武漢中博生物股份有限公司，
類型：發明
國別省市：湖北;42