神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的制造方法技術

開發一種大量地制造與被形成在患者的腦的不溶性聚集體同質的不溶性聚集體的方法。本發明專利技術的神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的制造方法包括:步驟（1），將來自神經退行性疾病的患者的腦的不溶性餾分植入在結構性地表達神經退行性疾病關聯蛋白質的培養細胞內；步驟（2），培養已植入所述不溶性餾分的所述培養細胞；步驟（3），從所述培養細胞萃取不溶性餾分。并且可能包括在培養細胞中增幅神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的步驟。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利摘要】開發一種大量地制造與被形成在患者的腦的不溶性聚集體同質的不溶性聚集體的方法。本專利技術的包括:步驟（1），將來自神經退行性疾病的患者的腦的不溶性餾分植入在結構性地表達神經退行性疾病關聯蛋白質的培養細胞內；步驟（2），培養已植入所述不溶性餾分的所述培養細胞；步驟（3），從所述培養細胞萃取不溶性餾分。并且可能包括在培養細胞中增幅神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的步驟。【專利說明】
本專利技術涉及人、和通過該方法所制造的不溶性聚集體。具體為涉及在結構性地表達神經退行性疾病蛋白質的培養細胞內，通過重復將來自所述神經退行性疾病的患者的腦的不溶性餾分作為晶種，進而使其形成不溶性聚集體的步驟的不溶性聚集體的制造方法、和通過該方法所制造的不溶性聚集體。
技術介紹
顯示各種疾病的特征性細胞內包含體(聚集體)出現在多數的神經退行性疾病的患者的腦內。在阿爾茨海默病(AD)中被稱為神經纖維纏結、在帕金森病(PD)中被稱為路易氏體的病理結構物全部為包括各種蛋白質的不溶性聚集體。作為神經纖維纏結的主要組成成分的Tau、作為路易氏體的主要組成餾分的α突觸核蛋白、以及作為被認定為肌萎縮性側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis:ALS)的泛素陽性的細胞內包含體的主要組成成分的43kDa的TAR DNA結合蛋白質(TDP-43)被分別證實。這些在正常情況下作為可溶性蛋白質存在著，但在患者腦中則作為不溶性的異常的聚集體沉積著，且其機制至今仍不清楚。再者，由于表達這些聚集體的出現部位與神經細胞的脫落(細胞死亡)部位相關，因此，被推測為與出現在細胞內的這些聚集體具有細胞毒性，從而最終使神經細胞至死進而導致發病有關的機制。因此，被認為，通過細胞內聚集體的形成機制和聚集體去解明細胞死亡誘發機制等之事，能夠對各種的神經退行性疾病的治療藥的開發等做出貢獻。為此，將于各種疾病的特征性細胞內聚集體再現于培養細胞內的體系構筑成為必要。但是，僅在細胞內表達過形成這些聚集體的蛋白質，從未出現于患者的腦中所見到的聚集體。近年，本申請的專利技術人們已確立了將用in vitro所制備的這些蛋白質的聚集體高效率地植入培養細胞內的方法(專利文獻1、非專利文獻I)。而且已表達:一旦將用in vitro所制備的所述聚集體植入事先已一時性地表達這些蛋白質的細胞內，則出現與在患者腦所見的細胞內聚集體其性質和形狀類似的聚集體。這些聚集體僅為在細胞內一時性地表達該蛋白質的情況下，并不被完全認可，但一旦用in vitro所制備的所述蛋白質的聚集體被植入在所述細胞內，則該聚集體被形成為聚集的核，即成為晶種，由此在所述細胞中被形成為新的聚集體。現有技術文獻專利文獻專利文獻I國際申請第W02007/066809號公開公報非專利文獻INonaka，T.等、J.Biol.Chem.285:34885 (2010)
技術實現思路
專利技術需要解決的問題由用in vitro所制備的所述蛋白質的聚集體被形成在細胞內的聚集體與伴隨所述神經退行性疾病的發展所出現的不溶性聚集體畢竟不同。在此，為了再現所述神經退行性疾病的發病過程，需要開發再現將在所述神經退行性疾病的患者的腦內所形成的不溶性聚集體作為種，進而在細胞內形成聚集體的過程的實驗體系。再者，為了詳細地解析在細胞內形成聚集體的過程，需要大量地得到在患者的腦內所形成的不溶性聚集體。但是，由于在患者的腦內所形成的不溶性聚集體其量受限，因此，需要開發制備相同性質的不溶性聚集體的方法。為解決以上問題的方法本專利技術提供一種，其包括:步驟(1)，其將來自神經退行性疾病的患者的腦的不溶性餾分植入在被結構性地表達神經退行性疾病關聯蛋白質的培養細胞內；步驟(2)，其培養已被植入所述不溶性餾分的所述培養細胞；步驟(3)，其從所述培養細胞中萃取不溶性餾分。本專利技術的包括:步驟(4)，其為在培養細胞中增幅神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的步驟，該步驟包括將從培養細胞中所萃取的不溶性餾分植入在結構性地表達神經退行性疾病關聯蛋白質的培養細胞內，且培養已植入所述不溶性餾分的所述培養細胞，并且從所述培養細胞中萃取不溶性餾分。本專利技術的可能包括:步驟(5)，其進一步至少I次連續重復所述步驟(4)。本專利技術的中，其神經退行性疾病關聯蛋白質有可能為從包括TAR、DNA結合蛋白質、α突觸核蛋白、Tau蛋白質、β -淀粉樣蛋白、多聚谷氨酰胺、SODl以及朊蛋白質的組中所選擇。本專利技術提供通過本專利技術的制造方法所獲得的所述神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體。本專利技術提供從生物學性試樣制造神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的方法。其包括:步驟(1)，其將從生物學性試樣中所萃取的不溶性餾分植入在被結構性地表達神經退行性疾病關聯蛋白質的培養細胞內；步驟(2)，其培養已被植入所述不溶性餾分的所述培養細胞；步驟(3 )，其從所述培養細胞中萃取不溶性餾分。本專利技術的從生物學性試樣制造神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的方法包括:步驟(4)，其為在培養細胞中增幅神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的步驟，該步驟包括將從培養細胞中所萃取的不溶性餾分植入在結構性地表達神經退行性疾病關聯蛋白質的培養細胞內，且培養已植入所述不溶性餾分的所述培養細胞，并且從所述培養細胞中萃取不溶性餾分。本專利技術的從生物學性試樣制造神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的方法有時包括:步驟(5)，其進一步至少I次連續重復所述步驟(4)。本專利技術提供通過從本專利技術的生物學性試樣制造神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體的方法所得到的來自生物學性試樣的所述神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體。本專利技術提供一種生物學性試樣的細胞毒性的檢查方法，其包括:將本專利技術的神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體，或將來自所述神經退行性疾病的患者的腦的不溶性餾分植入在結構性地表達所述神經退行性疾病關聯蛋白質的培養細胞內的步驟；和定量化所述培養細胞的細胞死亡的程度的步驟。一種神經退行性疾病的治療候補藥的篩選方法，其包括:將本專利技術的神經退行性疾病關聯蛋白質的不溶性聚集體，或將來自所述神經退行性疾病的患者的腦的不溶性餾分植入在結構性地表達所述神經退行性疾病關聯蛋白質的培養細胞內的步驟；和使神經退行性疾病的治療藥的候補化合物接觸所述培養細胞的步驟；以及將具有抑制所述培養細胞的細胞死亡的效果的所述候補化合物作為所述神經退行性疾病的治療候補藥進行篩選的步驟。在本說明書中的神經退行性疾病是指于患者腦的神經細胞內的特征性的病理結構物，即為伴隨由各種蛋白質組成的纖維性的不溶性聚集體的出現的疾病，現知為阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎縮性側索硬化癥(ALS)、額顳葉變性癥(frontotemporallobar degeneration:FTLD)、進行性核上性麻痹癥(progressive p supranuclear palsy:PSP)、皮質基底節變性癥(corticobasal degeneration:CBD)、皮克病(Pick)等。所述不溶性聚集體被推測為與成為細胞毒性的原因，從而最終使神經細胞至死進而導致發病有關。在本說明書中的神經退行性疾病關聯蛋白質，是指成為出現在神經退行性疾病的不溶性聚集本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：野中隆，增田雅美，山下萬貴子，秋山治彥，長谷川成人，
申請(專利權)人：公益財團法人東京都醫學綜合研究所，
類型：
國別省市：