突變改造的有機磷農藥降解酶及其編碼基因制造技術

本發明專利技術涉及通過基因工程改造得到的有機磷農藥降解酶。本發明專利技術所述的一種隨機突變改造的有機磷農藥降解酶，它是通過取代來源于施氏假單胞菌的有機磷農藥降解酶的3個氨基酸位點而產生的，所述的氨基酸取代位點是位于第7位、124位和246位的取代。本發明專利技術所述的有機磷農藥降解酶不但對毒死蜱和甲基對硫磷的降解活性更加優秀，而且還具有優秀的熱穩定性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程領域，涉及通過基因工程改造(隨機突變改造)的有機磷農藥降解酶。
技術介紹
農藥殘留嚴重危害生態環境，危害人民群眾的身體健康，是各國都需要面對的嚴峻問題。研究發現，不同地區的地下水、農作物及土壤都的遭受到了農藥殘留的污染。我國是農業大國，每年的農藥使用量巨大，隨之而來的農藥殘留問題也日趨嚴重。相關數據顯示我國農產品的農藥殘留超標嚴重，居民日常膳食中的各類農藥攝入量高于發達國家數十倍。近年來，農藥殘留的去除技術成為研究焦點，尋找一種安全、高效的去除農藥殘留的方法具有重要意義。農藥降解酶是去除農藥殘留的有效技術手段，具有降解迅速、使用安全、環境友好等特點。目前已經發現了多種農藥降解酶，例如有機磷農藥降解酶0ΡΗ、有機磷農藥降解酶ΜΡΗ、菊酯類農藥降解酶BI等。其中，國內外對于有機磷農藥降解酶研究的最為深入。有機憐農藥降解酶 OPH 最先在 Flavobacterium sp.ATCC27551 (Mulbry and Karns, 1989)和Pseudomonas diminuta MG (McDaniel et al.，1988)中分離得到,有機憐農藥降解酶 MPH首先由我國學者在Plesiomonas sp.strain M6中發現(崔中利等，2001)。有機磷農藥降解酶OPH和MPH都具有廣泛的降解譜，可以降解甲基對硫磷、毒死蜱、對硫磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、敵敵畏等農藥，是農藥降解酶領域的關鍵酶。有機磷農藥降解酶OPH的基因改造工作進行的比較深入，研究人員通過DNA shuffling技術成功將有機磷農藥降解酶OPH對甲基對硫磷的降解活性提高了 25倍(Catherine Mee-Hie Cho et al.，2002)，對毒死蜱的降解活性提高了 700多倍(Catherine Mee-Hie Cho et al.，2004)，這些成功的基因改造使OPH擁有了更優秀的酶學性質，有利于其在農藥殘留降解領域的應用，具有重要的實際應用價值。相對于有機磷農藥降解酶0ΡΗ，有機磷農藥降解酶MPH的基因改造并沒有獲得如此顯著的成果。研究人員通過定點突變，使有機磷農藥降解酶MPH獲得了更優秀的熱穩定性和酸喊穩定性(Jian Tian et al., 2010;Yidan Su et al., 2011 ；Lu Huang etal.，2012);通過隨機突變手段，獲得了一株突變位點為K173R的突變株，其對毒死蜱的降解效率比野生型酶提高了 41.55%(李亞楠等，2012)。有機磷農藥降解酶MPH在基因改造方面的研究還有待于深入研究和開發，通過基因工程手段改造有機磷農藥降解酶MPH，獲得酶活力和熱穩定性提高的突變體酶對于解決農藥殘留問題具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術目的在于利用基因工程手段改造有機磷農藥降解酶MPH，使其獲得更加優秀的酶活力和熱穩定性。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為:有機磷農藥降解酶MPH的N端35個氨基酸為信號肽序列，本專利技術隨機突變的對象為不含信號肽編碼序列的成熟mpd基因。采用易錯PCR的方法對Pseudomonas stutzeri strain ZK-5來源的有機磷農藥降解酶MPH編碼基因(mpd，GenBank登錄號JQ686087)進行隨機突變。易錯PCR反應體系(50 μ L)為:mpd基因(GenBank登錄號:JQ686087)50ng作為模板，上游引物和下游引物各0.3 μ M，dNTPs各 200μM，10μL突變緩沖液，5U Taq DNA聚合酶，5 μ LPCR緩沖液。易錯PCR反應條件為:94°C熱變性5min，94°C熱變性lmin，55°C退火lmin, 72°C延伸 lmin, 30 個循環。上游引物:5’-GAATTCTGCAGCACCGCAGGTGCGCACC-3’ 下游引物:5’ -TCCGGAAGCTTTCATCATCACTTGGGGTTGACGACCG-3’ 突變緩沖液組成為:dTTP4mM, dCTP4mM, MgCl227.5mM, MnCl22.5mM，溶劑為去離子水。PCR緩沖液組成為:100mM Tris-HCl pH8.3, 500mM KCl and 15mM MgCl2，溶劑為去離子水。對隨機突變獲得的mpd突變基因進行表達，純化突變酶，篩選酶活力和熱穩定性提高的突變酶，經過大量篩選，獲得I株隨機突變改造的有機磷農藥降解酶，其具有比野生型酶更優秀的酶活力和熱穩定性。經測序，本專利技術的有機磷農藥降解酶是通過取代具有氨基酸序列為SEQ ID N0.3的來源于Pseudomonas stutzeri strain ZK-5的有機憐農藥降解酶MPH的3個氨基酸位點而產生的，所述的氨基酸位點包括第7、124和246位的取代。在第7位用絲氨酸取代蘇氨酸，在第124位用天冬氨酸取代甘氨酸，在第246位用纈氨酸取代丙氨酸。本專利技術的有機磷農藥降解酶三維結構如圖5所示:本專利技術的有機磷農藥降解酶為同亞基二聚體，活性中心為雙鋅離子金屬活性中心，亞基的N末端通過氫鍵與另外一個亞基表面的凹槽結合，對二聚體結構的穩定性起到了關鍵作用。本專利技術的有機磷農藥降解酶在第7位的取代發生在亞基N末端，第124位的取代發生在loop環上，第246位的取代發生在α螺旋上，本專利技術的有機磷農藥降解酶通過上述3個位點的取代，獲得了比野生型酶更優秀的酶活力和熱穩定性。下面是隨機突變可參見的文獻:(I)Cadwell RC, Joyce GF(1992)Randomization of Genes by PCR Mutagenesis.Genome Res2:28-33.(2)Rasila TS，Pajunen MIj Savilahti H(2009)Critical evaluation of randommutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia colimutator strain, and hydroxylamine treatment.Analytical Biochemistry 388:71 - 80.本專利技術所具有的優點本專利技術獲得的隨機突變改造的有機磷農藥降解酶通過取代具有氨基酸序列為SEQID N0.3的來源于Pseudomonas stutzeri strain ZK-5的有機憐農藥降解酶MPH的第7、124和246位氨基酸位點，獲得了比野生型酶更優秀的酶活力和熱穩定性。由于酶活力和熱穩定性的提高，本專利技術的有機磷農藥降解酶降解效率高，高溫下不易失活，獲得了更大的實際應用價值，能夠廣泛應用于農產品及自然環境中農藥殘留的降解，為徹底解決農藥殘留問題提供了一種有效途徑。附圖說明圖1本專利技術的有機磷農藥降解酶和野生型酶對毒死蜱和甲基對硫磷的比活力；圖2本專利技術的有機磷農藥降解酶和野生型酶的熱穩定性；圖3對硝基苯酚標準曲線；圖4毒死蜱標準曲線；圖5本專利技術的有機磷農藥降解酶三維結構圖。具體實施例方式實施例1:本專利技術的有機磷農藥降解酶在大腸桿菌中的表達(I)PCR擴增:用上游引物 5’ -ATTCATATGGCCGCACCGCAGGTG-3’ 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
突變改造的有機磷農藥降解酶，其特征在于：所述的隨機突變改造的有機磷農藥降解酶具有SEQ?ID?No.2的氨基酸序列。

【技術特征摘要】
1.突變改造的有機磷農藥降解酶，其特征在于: 所述的隨機突變改造的有機磷農藥降解酶具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的突變改造的有機磷農藥降解酶，其特征在于: 它是通過取代具有氨基酸序列為SEQ ID N0.3的來源于Pseudomonas stutzeristrain ZK-5的有機磷農藥降解酶MPH的3個氨基酸位點而產生的，所述的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：謝建飛，張惠文，石元亮，盧宗云，徐明愷，張成剛，
申請(專利權)人：中國科學院沈陽應用生態研究所，
類型：發明
國別省市：